钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A增强氟康唑抗生物膜型白念珠菌的研究

发布时间：2017-10-29 21:41

  本文关键词：钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A增强氟康唑抗生物膜型白念珠菌的研究

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【摘要】：目的本研究旨在评价钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A(cyclosporine,CSA)对氟康唑抗生物膜型白念珠菌的增敏作用,并初步探讨其增敏作用的可能机制。方法收集2014年1-12月从宁夏医科大学总医院临床血流感染标本中分离出的白念珠菌,采用法国梅里埃公司全自动微生物分析仪(VITEK 2 COMPACT)将微生物鉴定到“种”水平。选取从临床血流感染分离的强产膜菌株CA NX05作为实验菌株,构建体外生物膜模型,并分析其生长动力学情况,明确菌株生长的对数期;采用荧光染色法定性观察生物膜的生长及形态,XTT法测定药物对生物膜型白念珠菌细胞活性的影响,并利用实时荧光定量q RT-PCR检测耐药及粘附相关基因ALS3、HWP1、CDR1、MDR及ERG11在m RNA表达水平的变化;利用水-烃两相分离实验检测药物对细胞表面相对疏水性的影响;利用流式细胞仪测定药物对细胞内钙离子浓度变化的影响。结果2014年1-12月从宁夏医科大学总医院临床血流感染标本中共分离出白念珠菌24株,其中4株强产膜菌株、6株中产膜菌株、14株弱产膜菌株,并将其中从临床血流感染中分离获得的强产生物膜型白念珠菌,命名为CA NX05(OD值最大);用显微镜观察结晶紫染色后的弱产膜株,发现大部分细胞以酵母样粘附于培养板底部,并且形成微菌落,只有少量成菌丝样细胞生长。观察CA NX05强产膜株时发现,大部分细胞是以菌丝样生长,菌丝相互交错生长,依稀能看见基底的酵母样细胞。动力学实验表明4-18h是菌株生长的对数增长期,当培养到24-48h时处于稳定期。根据棋盘法药敏实验结果提示,单用CSA对白念珠菌生物膜的抑制率很低,当浓度达到300μg/ml时抑制率仍小于10%。当单用FLC时,虽然抑制率有所升高,但是当浓度达到1024μg/ml时,真菌生长抑制率小于20%,与无处理组相比,差异没有统计学意义(P0.05)。然而当用浓度为75μg/ml的CSA与FLC联合使用时,FLC的MIC50为32μg/ml,相对于单用药降低了32倍之多,与单用FLC相比,差异有统计学意义(P0.05)。q RT-PCR检测结果显示当FLC和CSA联合使用时其耐药泵基因和粘附相关基因ALS3、MDR、CDR1、ERG11、HWP1的表达量与它们单独作用相比明显降低(P0.05);利用水-烃两相分离实验检测药物对细胞表面相对疏水性时,发现当加入钙调磷酸酶抑制剂后与单用氟康唑相比,其疏水性相对降低;采用流式细胞仪检测其胞内钙离子的浓度变化时,发现氟康唑加入以后,与没有加入药物相比其细胞内钙离子浓度变化很小,而加入抑制剂环孢菌素A以后随时间的增加其胞内钙离子逐渐增多,差异有显著性意义(P0.05)。结论1.白念珠菌在细胞培养板上能够形成典型的生物膜,通过荧光显微镜可以看到白念珠菌生物膜随着时间的增长其细胞数量和细胞外多糖基质也逐渐增多,48h以后能够形成典型的生物膜结构。2.生物膜型白念珠菌随着其不断地成熟对氟康唑的耐药性不断地增强,而加入钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A能够增强氟康唑抗生物膜型白念珠菌的敏感性。3.钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A对氟康唑抗生物膜型白念珠菌的增敏作用机制可能与降低耐药及粘附相关基因的表达量、降低细胞表面的疏水性及增加胞内钙离子浓度有关。
【关键词】：白念珠菌 生物膜 钙调磷酸酶 氟康唑 耐药基因
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文缩略语9-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-29
• 1.材料14-15
• 2.方法15-28
• 3.统计学分析28-29
• 结果29-40
• 讨论40-45
• 结论45-46
• 参考文献46-54
• 文献综述54-67
• 综述参考文献61-67
• 致谢67-68
• 攻读学位期间发表的学术论文68-69
• 个人简历69

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本文编号：1114797