伏马毒素降解菌的机制解析及降解酶基因的克隆

发布时间：2017-11-10 06:08

  本文关键词：伏马毒素降解菌的机制解析及降解酶基因的克隆

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【摘要】：伏马毒素(Fumonisins,FB)是一类由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等镰刀菌属(Fusarium spp.)在特定条件下产生的水溶性次级代谢产物,是一种污染分布较为普遍的真菌毒素。产毒菌侵染玉米和小麦等粮食作物不仅造成粮食减产,伏马毒素随着食品链条传递还严重危害人畜健康。近年来关于如何脱除粮油及其制成品中的伏马毒素已成为研究热点。本研究以筛选到的伏马毒素高效降解菌为研究对象,通过质谱分析等手段,解析了该菌株对伏马毒素的降解机制,进一步采用分子生物学手段,克隆获得了伏马毒素的相关基因,并通过构建工程菌使降解酶成功表达;通过HPLC和LC-MS解析降解酶对FB_1的降解产物,进一步确证该菌株对伏马毒素的降解机理。研究结果如下:以伏马毒素FB_1为唯一碳源,筛选获得一株伏马毒素高效降解菌,该菌在30℃,220 r/min条件下,培养5 d可将25μg(50μg/mL)的FB_1完全降解。通过对该菌株的形态观察,生理生化特征分析,并结合16S rRNA序列分析,该菌株被鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis sp.),命名为ASAG22。以ASAG22菌株的基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆出两段大小分别为1620 bp和1266 bp的伏马毒素降解酶基因序列,导入大肠杆菌的表达载体中,成功构建了工程菌YD和YI。通过对工程菌进行诱导,降解酶成功表达,通过纯化进行SDS-PAGE和Western Blot分析,结果表明,YD酶和YI酶大小分别为53 KD和48 KD,大小均与理论值一致。对菌株ASAG22降解FB_1的机理初步研究表明:菌株对FB_1的降解源于细菌产生的细胞内活性物质,且该活性物质经蛋白酶K处理后对FB_1的降解能力明显降低。对FB_1的降解产物进行质谱分析,发现FB_1降解为质荷比分别为406.3527、288.2099、264.1827和220.1569等高丰度新物质。用HPLC法研究纯化酶对FB_1的降解表明:YD酶可将FB_1完全降解,并产生一种新物质HFB_1。YI酶不能降解FB_1,但YI酶与10 mM丙酮酸共同作用可将HFB_1完全降解。酶解产物进行LC-MS解析发现,HFB_1为单一的质荷比为406.3527的物质,HFB_1经YI酶和丙酮酸的作用后转化为质荷比为405.3233(2-keto-HFB_1)和448.3643(2-acetamide-HFB_1)的物质。根据HPLC和LC-MS的检测结果可以推断:FB_1经YD酶处理,脱去2分子丙三羧酸生成HFB_1,HFB_1经YI酶和丙酮酸共同作用,使HFB_1上的氨基发生氧化生成2-keto-HFB_1,发生乙酰化生成2-acetamide-HFB_1,其中2-keto-HFB_1为无毒产物。
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915

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