抑制COX-2加重辐射所致小鼠结肠间充质干细胞损伤

发布时间：2017-11-10 06:14

  本文关键词：抑制COX-2加重辐射所致小鼠结肠间充质干细胞损伤

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【摘要】：研究背景和目的辐射可造成机体正常组织发生一系列的病理损伤改变,对辐射敏感的组织器官包括:免疫器官、造血器官、胃肠道、肺和脑等。其中,胃肠道是继免疫和造血器官之后,对辐射最敏感的组织器官之一,已成为放射生物学领域探究的热点。胃肠组织经辐射暴露后,可发生一系列的病理改变,主要表现为上皮细胞凋亡增多,隐窝生存减少,继而引起黏膜破损、胃肠功能障碍等。据统计,由辐射引起的肠道病变(radiation enteropathy)发生率甚至超过了临床上消化系统常见的炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD),因此,辐射所致肠道病变已成为临床迫切需要解决的重要难题,受到了业界的广泛关注。近年来的研究指出,环氧酶-2(cyclooxygenases-2,COX-2)在辐射所致肠道损伤中发挥着重要的保护作用。进一步的研究发现,肠组织隐窝附近少量存在的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可组成性地表达环氧酶-2(COX-2),以这些少量存在的MSCs为靶细胞,通过作用于COX-2信号途径,可减轻辐射所致的肠道损伤。而近年来的研究亦认为,MSCs对于维持肠道正常的生理功能具有十分重要的意义,并且在肠道损伤修复过程中发挥保护性作用,具有潜在的临床应用价值。众所周知,环氧酶抑制剂(cyclooxygenases inhibitors,COXIs),如阿司匹林和塞来昔布,在临床治疗实践中的应用极其广泛,涉及很多疾病的预防和治疗,如抗炎、抗血小板以及抗风湿等。这些药物均可以抑制COX-2的生物学活性。鉴于肠组织中表达COX-2的MSCs在辐射所致肠道损伤中的重要保护作用,那么临床广泛应用的能够抑制COX-2活性的药物,如阿司匹林和塞来昔布,是否会通过抑制COX-2活性增加肠组织间充质干细胞辐射损伤呢?其对辐照后肠组织又会产生怎样的影响呢?本课题以肠组织MSCs为中心,试图通过建立肠组织MSCs体外分离培养技术,探究COX-2抑制剂对MSCs辐射损伤的影响,以及COX-2抑制剂对辐射所致小鼠组织损伤的影响。为抗辐射防护剂的研发提供新的思路和理论依据;同时,为临床合理用药提供基础理论参考。实验方法1.小鼠结肠MSCs分离、培养通过两步消化法,从C57BL/6小鼠结肠组织中分离出MSCs,并在低糖培养基中进行体外培养。2.细胞鉴定显微观察细胞生长状态及形态特征;采用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)检测细胞表型;采用免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)、蛋白免疫印迹(western blot,WB)以及FACS技术检测细胞COX-2表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;利用体外诱导分化技术,分析细胞分化潜能;同时,采用Real-time PCR技术对细胞的干性相关基因进行初步检测分析。3.药物浓度筛选用不同浓度梯度的阿司匹林和塞来昔布预处理体外培养的小鼠结肠组织间充质干细胞(colonicmesenchymal stem cells,cMSCs),24 h后采用CCK-8法检测细胞活性,筛选合理的药物浓度用于后续的细胞实验。4.COX-2抑制剂对小鼠cMSCs中COX-2表达的影响用筛选得到的合理剂量的阿司匹林和塞来昔布预处理cMSCs,分别于24 h和48h后,采用WB技术对各处理组COX-2表达进行检测分析。5.建立细胞辐照模型(1)不同剂量电离辐射对cMSCs增殖活性的影响用不同剂量的~(60)Co-γ射线刺激cMSCs,辐照后24 h,采用CCK-8法检测各处理组细胞增殖活性,筛选合理的辐照剂量用于后续细胞实验。(2)辐照后,不同时间点cMSCs增殖活性改变用筛选得到的合适的辐照剂量刺激小鼠cMSCs,分别于辐照后6、24、48和72h,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,筛选合理的检测时间点用于后续的细胞实验研究。6.COX-2抑制剂对cMSCs辐射损伤的影响用阿司匹林(75μmol/L)和塞来昔布(20μmol/L)预处理小鼠cMSCs,24 h后给予细胞15 Gy ~(60)Co-γ射线辐照刺激,辐照后24 h,采用CCK-8法对各处理组细胞增殖活性进行检测分析。7.COX-2抑制剂对辐射后小鼠组织的影响分别对小鼠进行灌胃给药2 w,同时采用~(60)Co-γ射线对小鼠进行全身辐照处理,并对各处理组动物组织损伤改变进行观察分析。(1)肠道于指定时间点处死小鼠,迅速取出近端空肠和结肠组织,置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)中固定,采用HE和TUNEL染色观察比较各处理组小鼠肠组织病理改变;对于肠组织隐窝检测分析,动物处死前2 h,给予各小鼠腹腔注射120 mg/kg Brd U,然后利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术对各处理组小鼠肠组织中隐窝生存情况进行观察分析。(2)胸腺、脾脏于指定时间点处死小鼠(动物处死前称量体重并记录),迅速取出各处理组小鼠的胸腺和脾脏,称量脏器重量,并计算出相应的脏器系数。(3)骨髓于指定时间点处死小鼠,迅速取出各处理组小鼠的股骨,将骨组织置于4%PFA中固定,采用HE和TUNEL染色观察骨髓病理改变。实验结果一、小鼠cMSCs分离培养与鉴定1.细胞基本特征经显微观察发现,细胞呈贴壁状态生长,细胞形态为成纤维细胞状,且传代培养后细胞形态不发生改变。2.所分离培养的小鼠结肠间充质细胞表达CD29和CD44表型分子流式细胞术检测结果显示,培养到第三代的小鼠结肠间充质细胞高表达CD29和CD44两种常见的间充质干细胞表面标志物,其中,CD29分子阳性的细胞占(97.48±1.18)%,CD44分子阳性的细胞达到(91.18±1.97)%。3.所分离培养的细胞具有一定的增殖能力采用CCK-8法对培养三代以后的小鼠结肠间充质细胞的增殖活性进行检测,结果显示,随着培养时间的延长,细胞增殖呈上升趋势。4.所分离培养的小鼠结肠间充质细胞具有一定的分化能力对培养三代以后的小鼠结肠间充质细胞进行诱导分化培养,结果显示,经一段时间培养后,该细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞。5.所分离培养的小鼠结肠间充质细胞可表达Bmi 1和Lrig 1干性基因采用Real-time PCR技术对细胞干性基因进行分析,结果显示,该细胞可能表达Bmi 1和Lrig 1干性基因。6.所分离培养的小鼠cMSCs表达COX-2ICC、WB以及FACS检测结果显示,cMSCs表达COX-2。二、阿司匹林和塞来昔布对正常体外培养的小鼠cMSCs的影响1.不同浓度阿司匹林和塞来昔布对正常体外培养的小鼠cMSCs细胞活性的影响CCK-8结果显示,阿司匹林在最高浓度为100μM的范围内没有对cMSCs产生明显的细胞毒性作用(P=1.000);与正常未给药组相比,20μM塞来昔布给药组的细胞活力未出现明显改变[(94.58±7.04)%vs(100.00±6.01)%,P=1.000]。2.阿司匹林和塞来昔布对细胞COX-2表达的影响WB检测结果显示,75μM阿司匹林和20μM塞来昔布预处理后,cMSCs中COX-2表达未出现明显改变。三、钴60-γ射线辐照对体外培养的小鼠cMSCs的影响1.不同剂量钴60-γ射线辐照对cMSCs的影响CCK-8检测结果显示,钴60-γ射线对cMSCs具有一定的增殖抑制作用。与正常对照组相比,15 Gy辐照组细胞增殖率显著降低[(86.98±6.61)%vs(100.00±4.53)%,P0.01]。2.辐照后,不同时间点小鼠cMSCs损伤改变CCK-8检测结果显示,与正常对照组相比,辐照后6 h cMSCs增殖活性未发生明显改变[(95.62±4.57)%vs(100.00±1.53)%,P0.05];但是24 h后细胞增殖率显著下降[(89.90±2.16)%vs(100.00±1.53)%,P0.01],然而,随着时间的继续延长,细胞增殖未出现明显的进一步下降趋势(P0.05)。四、COX-2抑制剂对cMSCs辐射损伤的影响CCK-8检测结果显示,与正常对照组相比,辐照后,体外培养的小鼠cMSCs细胞增殖显著抑制[(90.22±1.70)%vs(100.00±5.37)%,P=0.012];给予阿司匹林预处理后,细胞辐射损伤未出现明显加重[(86.67±4.94)%vs(90.22±1.70)%,P=0.321];但是,与辐照组相比,辐照+塞来昔布组细胞增殖显著降低[(80.86±0.96)%vs(90.22±1.70)%,P=0.025]。五、COX-2抑制剂对辐射后小鼠肠道的影响HE染色结果显示,全身辐照后,各处理组小鼠肠组织病理未见明显差异;TUNEL染色结果显示,给处理组之间肠组织细胞凋亡没有出现明显改变。同时,辐照后,各处理组小鼠肠组织隐窝生存情况亦未见明显改变。提示所给剂量的阿司匹林和塞来昔布未加重辐射后小鼠肠道损伤。六、COX-2抑制剂对辐射后小鼠胸腺和脾脏的影响与对照组相比,低剂量(4 Gy)辐照组小鼠的胸腺脏器系数在辐照后3.5 d显著降低[(34.11±5.74)%vs(100.00±16.37)%,P0.01],提示胸腺损伤;同时,辐照后,小鼠出现明显的脾损伤,主要表现为脾脏器系数下降[(35.30±4.71)%vs(100.00±10.30)%,P0.01]。与低剂量辐照组相比,高剂量(8 Gy)辐照组小鼠的胸腺脏器系数在5.5 d时降低幅度更大[(13.19±1.96)%vs(40.40±13.46)%],但两种辐照剂量组之间脾脏器系数在5.5 d时降低程度相近[(30.28±1.13)%vs(31.20±1.17)%];高剂量辐照后第7 d,辐照组小鼠胸腺脏器系数较5.5 d时有所升高[(34.03±8.40)%vs(13.19±1.95)%],此外,脾脏器系数亦有所升高[(37.32±2.10)%vs(30.28±1.13)%]。与对照组相比,药物预处理后,小鼠胸腺和脾脏器系数均未显著降低。七、COX-2抑制剂对辐射后小鼠骨髓的影响HE染色结果显示,全身辐照后,小鼠出现明显的骨髓抑制。与对照组相比,辐照组小鼠骨髓中细胞明显减少,同时空泡明显增多;进一步的TUNEL染色结果显示,辐照后C57BL/6小鼠骨髓中凋亡细胞显著增多。与对照组相比,药物预处理组小鼠骨髓组织并未发生明显的病理损伤改变。结论1.我们成功建立了肠组织MSCs体外分离培养方法;2.小鼠cMSCs表达COX-2;3.钴60-γ射线可造成cMSCs损伤;4.COX-2选择性抑制剂塞来昔布可加重cMSCs辐射损伤;5.阿司匹林(15 mg/kg/d)和塞来昔布(60 mg/kg/d)对正常C57BL/6小鼠的胸腺、脾脏、骨髓和肠组织无明显的损伤作用;6.钴60-γ射线(4、8 Gy)全身辐照对C57BL/6小鼠胸腺、脾脏和骨髓造成明显的损伤,而对肠组织未造成明显的病理损伤改变;7.阿司匹林和塞来昔布预处理未加重全身辐照后小鼠组织损伤。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965

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