GPCR信号通路研究模型的建立与应用及孤儿受体的药物筛选

发布时间：2017-11-28 07:32

  本文关键词：GPCR信号通路研究模型的建立与应用及孤儿受体的药物筛选

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【摘要】：G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)主要通过激活G蛋白调节下游信号,从而参与某些生理病理反应,而β-arrestin作为细胞内的一种重要骨架蛋白,在绝大部分GPCR介导的信号转导中具有重要调节作用,调控GPCR脱敏、内吞、细胞增殖和基因转录,因此通过研究GPCR与β-arrestin的相互作用来研究GPCR介导的β-arrestin信号通路显得非常必要。本文通过构建叩头虫荧光素酶(Brazilian Cratomorphus distinctus;Emerald Luc;ELuc)片段分别与AGTR1(β2AR,GCGR)和β-arrestin1/2融合表达质粒,其N端(1-415 aa)与β-arrestin1/2 N端融合(ELucN-β-arrestin1/2),C端(394-542 aa)与AGTR1(β2AR,GCGR)C端融合(AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC),瞬转至HEK293细胞中,分别采用Western blot、免疫荧光染色及钙流实验,验证融合表达质粒在HEK293细胞中的表达及其生物学活性,然后共转AGTR1/β2AR/GCGR-ELucC和ELucN-β-arrestin1/2至HEK293细胞中,通过对细胞转染条件的优化以及化合物刺激时间的研究,检测在配体刺激下AGTR1(β2AR,GCGR)与β-arrestin1/2相互作用情况,并利用该检测模型对已报道的AGTR1、β2AR的偏向性激动剂进行验证。研究发现,在该模型检测下Angiotensin-2、Isoproterenol分别能够剂量依赖性的引起AGTR1、β2AR与β-arrestin1/2相互作用的改变,同时对于偏向性激动剂的验证中,只有Angiotensin-2能激活AGTR1介导的Gq信号通路,而Angiotensin-2、S-2、TRV120023均能剂量依赖性增强AGTR1与β-arrestin1/2相互作用,Isoetharine、Ethylnorepinephrine在激活β2AR时更偏向于β-arrestin1/2信号通路,这些结果均与文献报道相符,表明我们成功地构建了AGTR1、β2AR与β-arrestin1/2相互作用检测模型,而且该模型可靠、准确,为GPCR信号转导通路及其偏向性激动剂研究奠定了良好的基础。此外,我们按照相同的方式利用ELuc片段互补分析建立了β2AR与G蛋白相互作用检测模型,研究了β2AR与Gα16相互作用情况,并结合免疫共沉淀的结果,我们得知在β2AR激活时,β2AR与Gα16和Gαs的相互作用并未发生显著性改变。本论文的第二部分为利用cAMP实验构建孤儿受体GPR85、GPR98小分子配体的高通量筛选模型,并利用国家新药筛选中心化合物展开大规模随机筛选,从总共筛选的10万个化合物中,我们得到了8个在GPR98上具有一定活性的化合物,我们将进一步进行相关的研究。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91

【参考文献】

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1 薛礼;赵菡;刘俊科;邹伦浩;刘林青;黄思罗;;G蛋白偶联受体寡聚体结构研究进展[J];现代生物医学进展;2015年08期

2 武君;沈秀张;林吉进;;蛋白质与蛋白质相互作用研究技术[J];中国分子心脏病学杂志;2008年02期

3 谢小燕,夏宁邵;生物学中荧光共振能量转移的研究应用进展[J];生物技术通讯;2001年03期

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本文编号：1233216