新型STAT3抑制剂K9抗多发性骨髓瘤的机理研究

发布时间：2017-12-13 07:28

  本文关键词：新型STAT3抑制剂K9抗多发性骨髓瘤的机理研究

  更多相关文章： K9 多发性骨髓瘤 JAK2 STAT3 白介素-6

【摘要】：目的:STAT3即信号传导和转录激活因子3,是调节细胞内一系列基因表达的重要转录因子,在细胞凋亡和细胞周期等细胞生理过程中发挥着重要的作用。在多发性骨髓瘤中,STAT3被异常激活而失调,同时与临床上骨髓瘤病人的不良预后和耐药密切相关。目前,靶向STAT3信号通路来设计相关STAT3抑制剂已成为抗骨髓瘤药物研发的新策略之一。本研究旨在通过高通量筛选方法发现新的STAT3抑制剂,并阐释其抗骨髓瘤的作用机制,为临床上靶向药物治疗多发性骨髓瘤提供参考。方法:(1)利用基于荧光素酶报告基因的高通量筛选方法,从56,000个小分子化合物中寻找新型STAT3抑制剂。(2)通过Immunoblotting技术和流式细胞技术,检测K9对多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)细胞凋亡的影响。(3)通过构建裸鼠肿瘤异体移植模型,分析K9对体内肿瘤生长的影响。(4)使用Immunoblotting技术,检测K9对MM细胞本底以及IL-6所诱导的STAT3磷酸化的影响;同时,通过MM细胞与骨髓基质细胞共培养实验,检测K9对STAT3磷酸化的影响。(5)分别通过Immunoblotting技术、分子对接和体外酶活性测定方法,分析K9对STAT3上游各激酶活性的影响。(6)利用免疫共沉淀法和荧光素酶报告基因技术,检测K9对STAT3二聚化以及转录活性的影响。(7)RT-PCR和Immunoblotting技术分析K9对STAT3靶基因MCL1和XIAP转录表达的影响。(8)通过IL-6刺激实验和STAT3过表达实验,考察过度激活或过表达STAT3是否影响K9所诱导的MM细胞凋亡。(9)K9与阿霉素(DOX)进行联合用药,考察K9是否影响DOX的抗肿瘤活性。结果:(1)通过高通量筛选和前期实验,发现化合物k9为候选的stat3抑制剂。(2)immunoblotting分析发现,k9能够促进mm细胞(nci-h929、kms12、oci-my5、rpmi-8226和u266)中凋亡相关蛋白parp和caspase3的剪切,进一步通过流式细胞分析技术发现,k9能够诱导mm细胞凋亡。(3)k9能够抑制肿瘤异体移植模型中骨髓瘤的生长。同时,通过测定裸鼠体重发现,给药组与对照组体重没有差别。另外,通过血液分析发现,给药组中wbc、rbc、hgb和plt与对照组相比无显著差异,这些结果提示,k9在体内的毒性较小。(4)stat3在5种mm细胞中异常激活。同时,k9能够有效抑制mm细胞中本底或者il-6所诱导的stat3的活化,而对stat家族其它蛋白stat1和stat5的活化基本没有影响。另外,mm细胞与骨髓基质细胞共培养条件下,k9依然能够抑制stat3的活化。(5)k9通过特异性抑制stat3信号通路上游激酶jak2的活化来抑制stat3信号通路,而对其它相关激酶的活化没有影响,包括mtor、p38、erk和c-src等。另外,分子对接实验发现,k9能够很好地结合到jak2的活性口袋中,并能有效抑制jak2的活化。(6)k9能够有效抑制stat3驱动的pstat3-luc荧光素酶活性,同时k9也能显著抑制stat3下游靶基因ccnd2的启动子活性,而对不含有stat3结合单元的荧光素酶活性没有影响。另外,k9对另一重要的转录因子nfκb所驱动的荧光素酶活性也没有影响。同时,co-ip结果显示,k9能够有效抑制stat3的二聚化。(7)rt-pcr和immunoblotting技术分析发现,k9显著抑制stat3下游靶基因mcl1和xiap的转录表达。(8)il-6所诱导的stat3的活化能够部分抑制k9所诱导的mm细胞的凋亡;同时,过表达stat3后发现,其也能减弱k9对mm细胞的敏感性。(9)联合用药实验发现,k9能够促进dox的抗mm活性。结论:在体内和体外实验中,k9都表现出较强的抗mm活性,并且其体内毒性比较低。同时,k9通过特异性抑制jak2/stat3信号通路来调控细胞凋亡和细胞周期进程,进而抑制mm细胞存活。k9可作为一种新型stat3抑制剂,希望本文能为开发新型抗MM药物提供参考。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：1284309