丹参酮ⅡA抑制肺间质纤维化的机制研究

发布时间：2018-01-18 23:54

本文关键词： 丹参酮ⅡA 特发性肺间质纤维化上皮细胞间质转化 TGF-β/Smad 小窝蛋白-1　出处：《大连医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：特发性肺间质纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)严重威胁人类健康和生命,是最难治的慢性纤维化性肺部疾病,其发病率呈逐渐上升趋势,死亡率高。但因发病机制至今仍不明确,目前尚无有效的治疗方法。2011指南指出肺移植是目前唯一有效的治疗办法,尚没发现哪种药物对IPF有效,研究提示某些药物对IPF患者可能有益。因此,继续寻找有效的治疗IPF的药物仍是目前研究之重。丹参是一种经典传统中药,对活血化淤有效,从丹参中提取的脂溶性活性成分之一丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是目前研究较多的一种单体成分,主要因为丹参酮ⅡA是众多丹参酮成分中最为稳定的有效活性成分,且其含量最高,分子结构明确,具有丹参的大部分药物效应,在临床上常用于心血管病的治疗。近来大量研究表明丹参酮ⅡA作用很多,包括清除氧自由基、抗炎,抗肿瘤等多种药学活性及多种脏器保护作用。肺泡巨噬细胞过度浸润与肺纤维化的异常炎症反应有关,先前的研究不仅发现丹参酮ⅡA抑制博来霉素诱导的大鼠肺组织炎症反应,而且可以减轻肺纤维化。因此,我们首先用博来霉素建立肺纤维化大鼠模型,进一步验证丹参酮ⅡA抑制纤维化肺组织炎症反应的作用,发现丹参酮ⅡA可使肺泡巨噬细胞标志物CD68表达下降。同时从形态学角度证实丹参酮ⅡA可以减轻肺纤维化,抑制胶原沉积。最新的研究认为,肺泡上皮损伤和病理性损伤修复在IPF发生发展中起重要作用,具体表现在以下几个方面:肺泡上皮损伤;上皮细胞间质转化(Epithlial to mesenchymal transition,EMT);纤维细胞灶形成;端粒受损变短等,其中有研究报道,EMT是成纤维细胞的主要来源之一,主要表现细胞黏附分子中的E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达缺失,上皮细胞标志物下调,间质细胞标志物中的波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白(Fibronetin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达上调,细胞极性消失,类似成纤维细胞形态。越来越多的证据表明EMT发生与肺纤维化进展密切相关,是目前研究热点内容。FU等发现丹参酮ⅡA阻断MCF-7和HCC1973乳腺癌细胞系EMT的发生。Wang等也报道丹参酮ⅡA抑制EMT及体内肝细胞癌转移。这两个实验证明丹参酮ⅡA在乳腺癌及肝癌中的EMT的发生有抑制作用。我们前期工作发现丹参酮ⅡA有抑制肺纤维化的作用,因此,猜测丹参酮ⅡA有可能是通过抑制EMT而减轻肺纤维化,然而,关于丹参酮ⅡA对纤维化肺疾病EMT作用的细胞及分子机制的研究很少。我们预实验结果表明博来霉素诱导的纤维化肺组织E-cadherin表达减少,而Fibronectin和Vimnetin表达增加,经过丹参酮ⅡA预处理组上述因子变化被逆转,证明丹参酮ⅡA可以抑制EMT发生。因此将对其进行深入研究。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一种细胞因子,功能较多,主要通过影响细胞的增生、分化、凋亡、细胞外基质生成来调节组织的形态发生及分化,被公认为最重要的促纤维化因子,是各种纤维化中EMT的主要触发因素,其中包括肾小管上皮细胞、角膜上皮细胞和肺泡上皮细胞EMT等。参与肺纤维化EMT的信号通路有很多,其中TGF-β/Smad是最经典的一种信号通路,Smad是TGF-β的下游因子,研究证明,TGF-β能诱导肺泡上皮细胞发生EMT,主要是通过活化了的Smad2/3,促进肺纤维化形成。有学者研究丹参酮IIA抑制肾间质纤维化的作用,发现在肾脏成纤维细胞中,丹参酮IIA主要通过抑制TGF-β1/Smads信号传导通路发挥作用;最近的研究展示丹参酮ⅡA可以显著减少博来霉素诱导的肺纤维化的炎症反应及减少大鼠肺组织TGF-β1的表达。但是,丹参酮ⅡA对TGF-β信号依赖的EMT发生及对肺纤维化疾病潜在机制的作用还不是很清楚,因此,我们的研究假设丹参酮ⅡA能调整IPF的发生过程中TGF-β相关的EMT过程,从体内体外两个方面研究其潜在的分子机制。小窝蛋白-1(Caveolin-1)具有维持小窝形态结构及功能的作用,是小窝的标志性蛋白。其中脚手架结构域(Caveolin scaffolding domain,CSD)是Caveolin-1与胞内其他信号分子相互作用的区域,为多种信号分子的负性调节因子。Caveolin-1在多数分化细胞中表达丰富,其中包括肺泡Ⅰ型上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等。近几年,一些学者研究发现:IPF患者及博来霉素诱导大鼠肺组织中存在着Caveolin-1的表达下调;Caveolin-1基因敲除小鼠,Caveolin-1表达明显下降,肺部出现类似肺纤维化病变,Kasper等发现经TGF-β1处理后的肺组织,上皮细胞中Caveolin-1的表达明显下降,以上研究均提示Caveolin-1参与了肺纤维化的发生发展过程。又因Caveolin-1负性调节多种信号通路发挥作用,其中TGF-β/Smad信号通路研究较多。已有文献报道,Caveolin-1与TGF-β1Ⅰ型、TGF-βⅡ型受体及Smad2等共同定位在细胞质膜丰富的区域,Caveolin-1通过CSD与TGF-β1Ⅰ型受体及TGF-βⅡ型受体作用,负性调节TGF-β与受体结合,阻断TGF-β/Smad信号通路。我们通过对丹参酮ⅡA抑制TGF-β依赖的EMT过程的体内体外研究,发现丹参酮ⅡA抑制博来霉素诱导的肺巨噬细胞增加、胶原沉积、EMT过程及TGF-β/Smad信号通路的激活。体外实验也证实丹参酮ⅡA抑制A549细胞中TGF-β信号通路以及EMT,但是丹参酮ⅡA是通过哪些途径起到这样的作用尚不清楚,Caveolin-1是TGF-β信号通路的上游因子,在肺纤维化过程中,Caveolin-1的表达下降;增加Caveolin-1的表达可以抑制TGF-β信号通路,达到一定程度抑制肺纤维化的目的,因此,既然Caveolin-1和丹参酮ⅡA都有抑制TGF-β信号通路的作用,我们是否可以猜想丹参酮ⅡA抑制肺纤维化的作用可能与Caveolin-1有关呢?我们主要通过体外实验研究丹参酮ⅡA是否通过Caveolin-1调控下游的TGF-β/Smad信号通路介导的EMT过程,从而达到抑制肺纤维化目的?为临床新药开发提供更多的理论基础。第一部分丹参酮ⅡA抑制博来霉素诱导的肺纤维化目的:探讨丹参酮ⅡA对肺纤维化大鼠的肺组织形态学变化及Ⅰ型胶原、羟脯氨酸含量、CD68表达的影响,以明确丹参酮ⅡA对肺间质纤维化有无保护作用。方法:清洁级SD大鼠,体重约250g,采用随机数字表法分为对照组(Control),丹参酮ⅡA组(TanⅡA),纤维化组(BLM),丹参酮ⅡA+纤维化(BLM+TanⅡA),每组6只。各组干预28天,处死所有大鼠,取肺组织,计算肺组织的湿/干重比,对肺组织进行石蜡包埋后行组织病理学检测及ELISA检测各组大鼠肺组织中的Ⅰ型胶原及羟脯氨酸含量,通过免疫组织化学方法检测肺巨噬细胞标志物CD68的表达。结果:丹参酮ⅡA+纤维化组的大鼠肺湿/干重比明显低于纤维化组;HE染色可见丹参酮ⅡA+纤维化组与纤维化组比较肺泡间隔纤维增生灶较少,累及病变范围较小,肺实质结构破坏较少,Masson染色提示胶原纤维减少;纤维化组Ⅰ型胶原及羟脯氨酸含量、CD68表达与对照组比较明显升高,丹参酮ⅡA+纤维化组与纤维化组比较Ⅰ型胶原及羟脯氨酸含量、CD68表达下降。结论:丹参酮ⅡA抑制博来霉素诱导的大鼠肺组织肺泡巨噬细胞标志物CD68表达,减轻炎症反应;丹参酮ⅡA抑制Ⅰ型胶原及羟脯氨酸含量,减少细胞外基质沉积,减轻肺纤维化。第二部分丹参酮ⅡA抑制TGF-β依赖的EMT机制研究目的:研究丹参酮ⅡA对博来霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织及TGF-β1刺激的A549细胞EMT生成及TGF-β/Smad通路的影响,进一步探讨丹参酮ⅡA改善肺间质纤维化的作用机制。方法:体内实验分为对照组(Control),丹参酮ⅡA组(TanⅡA),纤维化组(BLM),丹参酮ⅡA+纤维化组(BLM+TanⅡA),每组6只。各组干预28天,处死所有大鼠,取肺组织;体外实验分为4组:对照组(Control):10μM的DMSO;丹参酮ⅡA组(TanⅡA):10μM的丹参酮ⅡA;TGF-β1组(TGF-β1):10μM的DMSO+10ng/ml的TGF-β1;丹参酮ⅡA+TGF-β1(TGF-β1+TanⅡA):10μM的丹参酮ⅡA+10ng/ml的TGF-β1。通过免疫荧光方法检测各组大鼠肺组织及各组细胞E-cadherin的表达;Real-time PCR检测各组大鼠肺组织TGF-β1RNA水平的表达;Western blotting检测各组大鼠肺组织及各组细胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、E-cadherin、α-SMA、Fibronectin和Vimentin蛋白水平的表达。结果:免疫荧光染色检测结果提示纤维化组与对照组及丹参酮ⅡA组比较,E-cadherin的阳性染色减少,丹参酮ⅡA预处理后E-cadherin的表达被部分恢复;Western blotting及Real-time PCR结果发现纤维化组、TGF-β1组分别与对照组比较,E-cadherin表达明显下降,α-SMA、Fibronectin和Vimentin蛋白表达明显升高,TGF-β1RNA及蛋白表达、p-Smad2、p-Smad3表达均升高,加入丹参酮ⅡA干预性治疗组上述因子表达均被逆转,差异有显著性。而且丹参酮ⅡA对Smad2、Smad3的表达无影响,仅能影响Smad2、Smad3的磷酸化水平。结论:丹参酮ⅡA通过抑制博来霉素诱导的肺组织EMT及TGF-β/Smad信号通路的激活,减轻肺纤维化;丹参酮ⅡA抑制TGF-β1刺激的A549细胞TGF-β信号依赖的EMT形成。第三部分丹参酮ⅡA通过上调Caveolin-1抑制TGF-β1刺激的A549细胞EMT目的:进一步体外实验探讨丹参酮ⅡA是否通过Caveolin-1调控下游TGF-β/Smad信号通路及EMT过程,为丹参酮ⅡA应用于临床,开发新药提供更多的理论基础。方法:我们首先用Western blotting检测第二部分四组细胞Caveolin-1蛋白水平表达。然后构建并筛选了转染效率高的Caveolin-1特异性sh RNA表达载体用于细胞转染,共分为7组:对照组(A);丹参酮ⅡA组(B):10μM的丹参酮ⅡA处理2h;Caveolin-1 sh RNA+丹参酮ⅡA(C):转染Caveolin-1 sh RNA 24h,然后用10μM的丹参酮ⅡA处理2h;TGF-β1(D):10ng/ml的TGF-β1处理48h;Caveolin-1sh RNA+TGF-β1(E):转染Caveolin-1 sh RNA 24h,然后用10ng/ml的TGF-β1处理48h;丹参酮ⅡA+TGF-β1(F):10μM的丹参酮ⅡA处理2h,然后用10ng/ml的TGF-β1处理48h;Caveolin-1 sh RNA+丹参酮ⅡA+TGF-β1(G):转染Caveolin-1sh RNA 24h,然后用10μM的丹参酮ⅡA处理2h,再用10ng/ml的TGF-β1处理48h。RT-PCR及Western blotting检测各组细胞TGF-β1、E-cadherin、Fibronectin和Vimentin RNA及蛋白水平表达。Western blotting检测各组细胞p-Smad2、p-Smad3表达。结果:TGF-β1组与对照组及丹参酮ⅡA组比较Caveolin-1的表达水平明显下降,经过丹参酮ⅡA预处理后Caveolin-1的表达明显升高,说明丹参酮ⅡA在纤维化过程中影响了Caveolin-1的表达;RT-PCR及Western blotting均提示丹参酮ⅡA(B组)与对照组(A组)比较TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin的表达变化不明显,但转染Caveolin-1sh RNA(C组)后,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表达升高,上皮细胞标志物E-cadherin表达下降,而间质细胞标志物Fibronectin与Vimentin表达升高;A549细胞转染Caveolin-1 sh RNA 24 h后,10 ng/ml TGF-β1处理细胞48 h(E组)与仅接受TGF-β1处理48 h(D组)比较,Caveolin-1 sh RNA+丹参酮ⅡA+TGF-β1(G组)与丹参酮ⅡA+TGF-β1(F组)比较,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表达升高,E-cadherin的表达明显下降,Fibronectin与Vimentin的表达升高,而经过丹参酮ⅡA治疗后上述因子的表达均被逆转。结论:丹参酮ⅡA增加了TGF-β1刺激的A549细胞Caveolin-1的表达;丹参酮ⅡA通过上调Caveolin-1抑制TGF-β1刺激的A549细胞TGF-β信号依赖的EMT。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965

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