乙酰胆碱酯酶加合物质谱定量方法及在重活化剂抗毒效能评价中的应用

发布时间：2018-02-05 21:32

  本文关键词： 神经性毒剂 效应标志物 胆碱酯酶加合物 酶解-质谱法 重活化剂　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：神经性毒剂(nerve agents,NAs)主要包括塔崩(GA)、沙林(GB)、梭曼(GD)、VX和俄罗斯VX(RVX),是一类对神经系统内乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)具有强抑制作用的有机磷酸酯类化合物。神经性毒剂可被用于制造恐怖事件的可能性凸显了对其毒理机制及医疗救治研究的重要性。根据其中毒机制,神经性毒剂暴露后最有效的急救手段是及时给予乙酰胆碱酯酶重活化剂。然而,梭曼中毒酶易老化、难重活化且尚无有效重活化剂是世界防化医学亟待解决的科学难题。目前对于神经性毒剂中毒特性及重活化剂效价的研究主要依赖于经典的Ellman酶活力测定法。然而,该方法存在诸多不足,例如易受基质、药物等干扰,导致表征结果不准确;更为重要的是该方法不能展示乙酰胆碱酯酶中毒后及重活化过程中的演变规律。随着现代仪器分析技术的发展,各种高灵敏的NA水解产物、大分子加合物等生物标志物的分析方法已能够满足NA中毒确证和溯源的要求。本课题借鉴蛋白质组学分析技术策略,首次提出了针对NAs毒性靶点AChE加合物即NAs效应标志物的分析技术方法,将现代仪器分析技术应用于NA毒性分析。具体而言,本课题基于酶解-质谱法的分析策略,将中毒效应酶AChE经胃蛋白酶酶解后产生三种含有活性加合肽段的相应效应标志物,即活性肽、中毒肽和老化肽,并建立其高效液相色谱-串级质谱联用(LC-MS/MS)定量测定技术。为了能“捕捉”效应酶在中毒及重活化过程中的实时演变或存在状态,经一系列试验考察,发现向体系中加入适量甲酸可使效应酶瞬间“冻结”。相比传统酶活力测定法,本方法不仅能给出效应酶中毒程度的数据,更能定量地获取效应酶中毒后所处的不同状态,特别是对于低剂量神经性毒剂暴露(效应酶抑制率小于20%)时,Ellman法无法准确判断酶活性抑制率,而本方法则可准确分析抑制率小于1%的情况。基于所建立的酶解-质谱分析方法,我们首先表征了四种经典神经性毒剂(塔崩、沙林、梭曼、VX)的中毒特性,计算了各NAs的中毒速率常数、老化速率常数及老化半衰期。随后,应用上述分析技术,评价了经典重活化剂(HI-6、双复磷、氯磷定、TMB-4和MMB-4等)、我所研发的新型重活化剂和复方药物对这四种神经性毒剂分别暴露后的中毒乙酰胆碱酯酶的重活化效价,并评价了预防药物的预防给药效果,探讨了药物的重活化作用机制。本课题建立的分析方法同样可用于其他类化合物(如胆碱酯酶抑制剂吡啶斯的明、有机磷农药毒死蜱)与胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)结合后的效应标志物的鉴定分析,为胆碱酯酶抑制剂的特征性鉴定及其毒理药理研究提供了全新的分析技术手段。本研究论文共分为五章:第一章前言,对神经性毒剂及其中毒机制、神经性毒剂生物标志物分析方法、神经性毒剂抗毒药研究进展进行了介绍,并对重活化剂评价方法以及我所新型重活化剂研究成果进行了评述。最后提出了本论文的研究意义与目的、研究内容和研究创新点。第二章神经性毒剂与胆碱酯酶加合物体外分析方法的建立,建立了四种典型神经性毒剂(塔崩、沙林、梭曼、vx)与电鳐ache、人丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,bche)加合物酶解后产生的三种含有活性加合位点的肽段(即活性肽、中毒肽和老化肽)的lc-ms/ms定量分析方法。运用高分辨质谱(lc-qtof-ms)技术确证了各特征性肽段的氨基酸序列和碎片特征,分析讨论了其碎裂规律。经方法学验证,本方法对未加合肽段的检测限为0.2nm,定量限为0.5nm,选择性、线性良好,精密度和准确度符合方法学要求,基质效应小,稳定性满足实际实验操作的需要。与传统ellman酶活测定法比较,新建酶解-质谱法不仅能准确地表征nas中毒胆碱酯酶的抑制率(与ellman法测得的抑制率相同),而且可以在nas极低浓度暴露时测定nas特异性肽段(中毒肽、老化肽)。由于其可以精准的测定胆碱酯酶所处的状态,所以比传统酶活法具有更高的灵敏度和特异性。第三章神经性毒剂中毒特征表征,应用所建立的酶解-lc-ms/ms方法,系统分析了ache、bche暴露于四种神经性毒剂(塔崩、沙林、梭曼、vx)后,三种特征性肽段(活性肽、中毒肽、老化肽)随时间的变化趋势,详细描述了各nas的中毒、老化特征。结果显示,生理条件下,梭曼暴露的ache,3分钟即可完成中毒并全部老化;vx中毒后,老化肽在1小时后可被检出;沙林中毒酶随时间发生一定程度的老化;塔崩中毒酶则存在两条老化途径。在0℃低温条件下,梭曼的中毒和老化过程明显减缓,中毒肽可以持续地被检出,且随着ph值的升高,梭曼暴露的ache中毒及老化均减缓。四种神经性毒剂暴露的bche,中毒速度相差不大。与暴露的ache相比,梭曼暴露的bche,中毒肽可以被持续地检出;沙林暴露的bche,老化肽在1小时内持续缓慢上升;vx暴露的bche20分钟后可以检测到老化肽。首次提出根据对na中毒胆碱酯酶特征性肽段质谱定量数据计算na中毒速率常数、老化速率常数及老化半衰期的计算方法。第四章抗毒药对神经性毒剂中毒胆碱酯酶的防治效果评价,基于所建立的酶解-质谱法,提出了一个全新的NAs重活化药物的评价方法。本方法从分子水平观测到活性肽、中毒肽、老化肽的变化关系并对其相对定量,通过纯酶组、中毒组、给药组活性肽的比较计算重活化率和相对胆碱酯酶活力,并根据中毒肽、老化肽的变化对重活化过程加以佐证。首次提出基于质谱法的药物重活化率、重活化剂EC50值计算公式,对经典重活化剂评价结果与文献报道一致。本方法避免了传统Ellman法易受干扰、灵敏度低、特异性差的缺点,给出药物重活化作用最直接的证据。因此,本方法可以用作Ellman法的替代方法用于NAs重活化剂等抗毒药物评价。对经典肟类重活化剂及我所研发的新型重活化剂和复方药物的评价结果表明,对于GB和VX中毒,各种药物均显示出较好的重活化作用。针对GA中毒,TMB-4、LuH、“85”急救方具有良好的重活化作用,L-1655、L-1978、MMB-4有一定的重活化效果;而对于梭曼中毒,因其中毒酶极易老化,目前可获得的重活化剂对梭曼中毒救治均无效,但是L-1655、L-1978及“85”预防片表现出良好的预防效果。值得关注的是,LuH、TMB-4等重活化剂表现出加重GD中毒的现象。本章基于分析毒理学的思路,根据效应标志物的变化,分析讨论了不同药物的重活化作用机制。第五章其他化合物与胆碱酯酶加合物特异性肽段分析,将酶解-质谱法应用于其他类化合物与胆碱酯酶结合后效应标志物的鉴定分析,建立了检测胆碱酯酶抑制剂吡啶斯的明、有机磷农药毒死蜱(chlorpyrifos,CP)与AChE、BChE加合物的酶解-LC-MS/MS定量分析方法。证实了NAs预防药吡啶斯的明通过与ChE活性丝氨酸位点发生共价结合而发挥预防NAs中毒的作用。研究还发现,CP与ChE于体外孵育后,发生加合作用的实际上是其氧化产物氧化毒死蜱(chlorpyrifos oxon,CPO)。本方法建立的CPO-AChE加合物定量分析方法可用于CP毒理机制研究,CPO-BChE加合物定量分析方法为临床中毒确证、救治提供新的鉴定手段。这些实例表明,本课题所建立酶解-质谱分析方法可广泛应用于胆碱酯酶抑制剂的特征性鉴定以及毒理药理研究。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R917
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本文编号：1492819