MAT1蛋白切割与其调控的RARα低磷酸化抑制髓性白血病细胞恶性增殖的作用及其机制研究
发布时间:2018-02-13 02:33
本文关键词: 髓性白血病 MAT1 CAK-RARα信号通路 粒向分化 基因转录 出处:《浙江大学》2015年博士论文 论文类型:学位论文
【摘要】:第一部分MAT1表达/切割对正常及恶性造血细胞增殖/分化的调控作用及其机制研究目的:髓性白血病是一类造血系统的克隆性恶性疾病,其发病机制尚未完全阐明且治疗效果有待提高。参与调节细胞周期和基因转录的MAT1蛋白在正常造血干细胞的粒向分化过程中发生切割,但其在全反式维甲酸(ATRA)耐药的髓性白血病细胞中则以全长形式高表达,提示MAT1的表达和切割与正常及恶性造血细胞的增殖和分化密切相关,但其调控机制尚不明确。本部分研究将以MAT1、正常造血干细胞和髓性白血病细胞为研究对象,系统探讨MAT1的表达和切割对正常及恶性造血细胞体内外增殖和分化的影响,并阐明相关作用机制。方法:本研究采用CD34+细胞(人源性造血干/祖细胞)、原代髓性白血病细胞和可传代的髓性白血病细胞株作为研究对象。(1)血球计数板结合台盼蓝染色法计数细胞数目,从而计算细胞生存率、死亡率与倍增时间;(2)采用分子克隆手段构建全长MAT1和其切割片段pM9质粒,并产出使细胞过表达MAT1和pM9的慢病毒;(3)Western Blotting法检测蛋白的表达和磷酸化水平;(4)流式细胞术检测细胞膜表面特异性抗原CD11b、CD66、CD34和CD19的表达量,或在动物模型中检测表达GFP荧光蛋白的细胞比例;(5)qRT-PCR法检测MAT1、 CD11b、CD66等mRNA转录水平;(6)瑞姬染色检测细胞核形态的改变;(7)免疫荧光法检测MAT1和p21Cip/Kip蛋白在CD34+细胞中的表达量;(8)液相色谱-质谱联用检测MAT1切割片段的氨基酸序列,以推测MAT1的切割位点;(9)免疫沉淀检测多种蛋白之间的结合水平;(10)HE染色和免疫组化染色检测组织切片中特定蛋白的表达和肿瘤细胞的形态。结果:(1)MAT1促进CD34+细胞扩增并抑制其粒向分化采用慢病毒转染技术在CD34+细胞中过表达MAT1后,发现MAT1的过表达不仅可拮抗内源性MAT1的切割降解,并且促进了CD34+细胞的体外扩增。与此同时,流式细胞术检测发现MAT1抑制细胞表达成熟粒细胞表面标记物CD66和CDl lb,瑞姬染色也证实MAT1过表达可抑制细胞核在ATRA诱导下出现粒细胞特异性的分叶状形变,提示 CD34+细胞的体外扩增和粒向分化受MAT1表达的调控。为进一步明确MAT1在体内对CD34+细胞的影响,将人源性间充质干细胞与CD34+细胞共接种于免疫缺陷的NSG小鼠,从而构建适宜CD34+细胞在体分化的微环境。通过流式细胞分选结合qRT-PCR分析,发现MAT1的过表达不仅促进CD34+细胞在骨髓内的归巢和在外周血中的扩增,而且抑制了细胞中CDllb和CD66的转录与表达,揭示MAT1在体内也具有促进CD34+细胞扩增并维持其干细胞特性的作用。由于上述过程伴随着细胞周期抑制蛋白p21Cip/Kip表达量的降低,提示MAT1可能通过下调p21Cip/Kip的表达促进造血干细胞扩增并且抑制其粒向分化。(2)MAT1的活性切割片段pM9通过调控CAK和TFIIH活性抑制髓性白血病细胞的恶性演进采用液相色谱-质谱联用分析全长MAT1和其切割片段M30的氨基酸序列,对比发现MAT1在C末端发生切割,从而产生M30和pM9两个片段。经分子克隆技术构建Flag标记的pM9质粒后,采用慢病毒转染技术在HL60、HL60R和Jurl-MKl三株髓性自血病细胞中过表达pM9,发现pM9不仅可降低内源性MAT1的表达,而且可与内源性MAT1竞争性结合cyclin H和CDK7从而构成ACAK。由于pM9不具备结合TFIIH XPD和XPB所需的结构域,ACAK无法与TFIIH核心结合从而构成完整的TFIIH激酶,因此pM9形成的ACAK能显著抑制内源性CAK和TFIIH的形成。进一步研究发现,pM9可抑制原代AML细胞和髓性白血病细胞株的体外增殖并促进原代细胞的粒向分化。Western Blotting结合qRT-PCR结果显示,上述作用可能是通过降低CDK7的磷酸化从而抑制CAK对下游蛋白CDK1和RARa的磷酸化激活,并且干预TFIIH介导的基因转录而实现的。但pM9的上述抑制作用仅局限于髓性白血病细胞,而对正常造血干细胞的扩增无明显影响,造成其敏感性差异的原因可能是pM9对RNA Pol II磷酸化水平的调控,以上结果提示pM9具有良好的肿瘤靶向性。在NSG小鼠白血病移植瘤模型中,pM9可模拟ATRA介导的MAT1切割,抑制ATRA耐受的髓性白血病细胞在体内的增殖与转移。结论:MAT1的表达促进造血干细胞的扩增并抑制其粒向分化,而MAT1的活性切割片段pM9可模拟MAT1的切割并形成ACAK,从而影响内源性CAK和TFIIH的形成与活性,最终特异性地抑制髓性白血病细胞的恶性增殖和转移。第二部分基于低磷酸化RARaS77抑制ATRA耐药的t(8;21)AML细胞基因转录的抗白血病增殖作用机制研究目的:非APL的急性髓性白血病(AML)细胞中的CAK-RARa信号通路阻滞是患者对ATRA分化疗法不敏感的原因之一。第一部分研究已经证实了MAT1的活性切割片段pM9可形成ACAK,从而减少内源性CAK对RARa的磷酸化并抑制髓性白血病细胞的恶性增殖与转移。在本部分研究中,将以ATRA耐药的t(8;21)AML为研究对象,考察RARa的磷酸化水平对基因转录与细胞增殖的影响,进而探讨RARa的磷酸化与白血病细胞耐受ATRA之间的相关性和分子机制,为设计基于干预RARa磷酸化的全新抗白血病药物提供思路及潜在靶点。方法:本研究采用原代t(8;21)AML细胞和可传代的t(8;21)AML细胞株作为研究对象。(1)采用分子克隆手段构建Flag标记的RARa和RARaS77A质粒,并产出使细胞过表达RARa和RARaS77A的慢病毒;(2)血球计数板结合台盼蓝染色法计数细胞数目,从而计算细胞生存率和死亡率;(3)DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡时的核小体片段;(4)Western Blotting法检测蛋白的表达和磷酸化水平;(5)qRT-PCR法检测mRNA的转录水平;(6)流式细胞术检测细胞周期和表达GFP荧光蛋白的细胞比例;(7)免疫沉淀检测多种蛋白之间的结合水平;(8)HE染色和免疫组化染色检测组织切片中特定蛋白的表达和肿瘤细胞的形态;(9)染色质免疫共沉淀结合qPCR分析特定蛋白对靶基因转录的影响。结果:持续低磷酸化的RARaS77突变体RARaS77A在多种髓性白血病细胞中的过表达可促进多种与细胞分化和凋亡相关的RA靶基因的转录,从而抑制细胞的体外增殖并诱导ATRA耐受的t(8;21)AML细胞株发生凋亡,而合用ATRA可进一步增强RARaS77A诱导的基因转录。在去除培养体系中的维甲酸或给予靶向RARa配体结合域的RARa抑制剂Ro 41-5253后,发现RARaS77A引起的细胞增殖抑制和促RA靶基因转录的作用未受影响。以上结果在原代t(8;21)AML细胞中也得到证实,提示RARaS77A的作用不依赖于配体作用以及RARa配体结合域的激活。将过表达RARaS77A的t(8;21)AML细胞株SKNO-1接种于免疫缺陷的NSG小鼠中,或同时给予ATRA后,采用流式细胞术检测骨髓和外周血中SKNO-1细胞的比例,发现与空白载体组相比,RARaS77A单独或与ATRA合用均能显著抑制SKNO-1细胞在骨髓和外周血中的增殖,并且抑制细胞向淋巴结发生转移。为进一步阐明低磷酸化的RARaS77是如何调控RA靶基因转录从而抑制t(8;21)AML细胞增殖,采用染色质免疫共沉淀法检测RARaS77A、RARa、RNA Pol Ⅱ和ETO等蛋白与RA靶基因RARE区域的结合。结果显示,RARβ2等RA靶基因的转录激活伴随着RARaS77A与靶基因RARE区域结合的增强,RNA Pol Ⅱ、TFIIH p89的募集和AMLl/ETO、HDACl、 DNMT3a的解离,提示RARaS77A可能通过改变RA靶基因启动子区域附近的抑制性染色质构型从而促进基因的转录。结论:RARaS77位点的低磷酸化可能通过改变染色质构型,以ATRA非依赖的方式诱导多种调控细胞分化和凋亡的RA靶基因的转录,从而抑制ATRA耐药的t(8;21)AML细胞的恶性增殖。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R96
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本文编号:1507124
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