阿帕替尼抗NSCLC作用靶点的再发现及其与绞股蓝总苷相互作用的研究

发布时间：2018-02-13 15:21

本文关键词： 阿帕替尼 BRAF V600E 非小细胞肺癌 HPLC-MS/MS 药物相互作用绞股蓝总苷 P-gp CYP3A4 CYP2D6 药动学　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景与目的肺癌是目前发病率和致死率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占80%-85%。近年来其发病率仍呈现不断上升趋势,严重威胁着人民的健康。由于大多数患者在确诊时已为不可手术的中晚期,需要进行药物治疗。根据患者个体情况给予合适的靶向制剂是改善预后的有效手段,因此针对靶向制剂的研究具有重要意义。阿帕替尼是我国首个完全自主研制的1.1类抗肿瘤药物,在体内主要通过原型高效抑制血管内皮细胞生长因子2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)发挥抗肿瘤活性,目前在胃癌的治疗中具有良好的安全性和有效性。此外,其临床前研究和Ⅱ期临床试验中展现了较好的抗肺癌活性,大大提高了患者的缓解率,延长了中位无进展生存期,具有良好的市场应用前景。然而,阿帕替尼在临床应用中仍存在以下问题:1)其它VEGFR2抑制剂对肺癌患者的临床疗效与阿帕替尼在临床试验中的结果差别较大,表明阿帕替尼的抗肿瘤作用机制尚不明确,有待进一步研究确认;2)临床治疗中,其成本-效益比远超患者支付意愿,对医疗资源利用率不高,临床应用比较局限。因此,发现阿帕替尼的作用靶点并阐述其作用机制,以及降低成本效益比,对推动阿帕替尼在临床应用中的个体化治疗,从而改善患者预后,具有重要意义。研究发现,蛋白激酶在肿瘤细胞中的异常表达与肿瘤的侵袭、迁移、新生血管的生成等密切相关,也已成为抗肿瘤药研究中的重要靶点和研究热点。课题组前期基于Life公司的LanthaScreen binding和ZLYTE平台,检测其对各蛋白激酶的作用活性,并结合各激酶在肺癌中的意义,初步确定了鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)V600E突变蛋白为其潜在靶点;此外,研究表明,药物暴露量与药物作用密切相关,针对药代动力学的药物相互作用是改变药物暴露量,改善成本-效果比的重要手段。本研究以BRAF V600E突变的NSCLC细胞株HCC364为对象,通过体内外实验验证该靶点,阐明阿帕替尼作用途径;同时,开展绞股蓝总苷(gypenosides,GP)干预阿帕替尼体内药动学的动物实验,以期提高其暴露量,改善成本-效果比。从而推进阿帕替尼在临床治疗中的个体化给药进程,造福更多患者。实验方法与结果1.用CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测阿帕替尼对HCC364(BRAF V600E突变)和HCC827(BRAF V600E野生)的增殖抑制活性,分析数据并计算各组细胞IC50值。结果显示,hcc364和hcc827细胞ic50分别为84.1nm和1024.1nm,其中阿帕替尼对hcc364的敏感性约为hcc827细胞的12倍,提示阿帕替尼对brafv600e突变的nsclc细胞具有更好的活性抑制作用。2.测定阿帕替尼对hcc364细胞周期、凋亡和迁移的影响。结果显示,与空白对照组比较,10,20和50nm阿帕替尼处理48h,能使hcc364细胞周期阻滞于g1期且促进其凋亡和抑制其迁移,且阿帕替尼的这些作用呈梯度依赖,提示阿帕替尼具有抑制brafv600e突变的非小细胞肺癌进展和恶化的潜力;3.免疫印迹法(westernblotting)分析阿帕替尼对braf肿瘤调控通路的影响。用50nm阿帕替尼处理hcc364细胞不同时间(0,15,30,60和120min),westernblotting分析细胞中braf下游蛋白丝裂原活化蛋白激酶的胞外信号调节蛋白激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinase/extracellularsignal-regulatedkinasekinase,mek)和细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,erk)的磷酸化。结果显示药物作用30min后能够显著抑制mek和erk的磷酸化,提示阿帕替尼抑制hcc364细胞活性可能与braf/mek/erk通路抑制有关。4.裸鼠皮下接种hcc364细胞建立体内brafv600e突变的nsclc荷瘤模型,模型成功后,通过灌胃给药,观察不同剂量阿帕替尼(32,65,100mg/kg·d)体内抑瘤作用和效果,实验设置维罗菲尼(250mg/kg·d)对照组。结果显示,维罗菲尼(250mg/kg·d)和不同剂量的阿帕替尼(32,65和100mg/kg·d)均能有效抑制肿瘤生长,抑瘤率分别为48.73%,51.58%,70.19%和72.49%。表明阿帕替尼在体内对brafv600e突变的nsclc具有良好的增殖抑制作用,且呈剂量依赖,其中低剂量阿帕替尼给药组的肿瘤抑制效果高于维罗菲尼对照组。瘤体蛋白检测数据表明,维罗菲尼和阿帕替尼给药组动物瘤体内mek和erk蛋白的磷酸化程度均有所降低。5.建立一套同时检测大鼠血浆中阿帕替尼原型及主要代谢产物(m1-1、m1-2、m1-6和m9-2)的hplc-ms/ms方法,并依据美国食品药品监督管理局(u.s.foodanddrugadministration,fda)和中国药典最新版的相关规定完成了方法验证。结果显示,选择性、线性、准确度、精密度、稀释效应、提取回收率和基质效应各指标均符合相关规定,所建立分析方法能在1-2000ng/ml范围内对大鼠血浆中阿帕替尼及其代谢产物药物浓度进行准确定量,为考察绞股蓝总苷对阿帕替尼药动学的影响提供技术支持与保障。6.观察不同剂量gp对阿帕替尼药动学的影响。结果显示,给予高剂量gp(400mg/kg)后,可使阿帕替尼原型及其代谢产物的暴露量显著增加,使m0、m1-1、m1-2和m1-6的auc0-24h分别升高为原来的3.53、2.69、2.53和1.90倍。此外,高剂量gp还可以降低阿帕替尼的代谢产物转化率。表明绞股蓝总苷可以显著改变阿帕替尼的药动学过程,增加体内暴露量。结论1.首次发现阿帕替尼对BRAF-V600E突变的NSCLC活性抑制具有极好的选择性,初步阐明阿帕替尼抑制BRAF V600E突变的NSCLC细胞的作用机制,即抑制BRAF/MEK/ERK肿瘤调控通路。体内实验进一步证实了上述调控通路,并提示阿帕替尼对BRAFV600E突变的NSCLC的抑制效果优于维罗菲尼。2.在动物水平,绞股蓝总苷可以干预阿帕替尼的药动学过程,提高阿帕替尼原型和Ⅰ相代谢产物暴露量,该联合应用方案具有降低阿帕替尼治疗成本的潜力,为开展阿帕替尼联合用药方案的后续研究提供了依据。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】