橘青霉甲基转移酶基因llm3的克隆和功能分析

发布时间：2018-02-17 00:42

本文关键词： 橘青霉 llm3 美伐他汀无性繁殖次级代谢　出处：《西南大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:丝状真菌是天然产物的宝库,从丝状真菌中分离的次级代谢产物大约有1500多种,一半以上的次级代谢产物都具有抗菌,抗肿瘤等活性。青霉素、环孢菌素、头孢菌素、辛伐他汀、多柔比星、阿维霉素等药物均来自丝状真菌。近年来研究表明,丝状真菌基因组中大量次级代谢基因簇处于沉默状态。在丝状真菌中,次级代谢基因簇的转录和翻译受到多种因子的调控,如全局性调控因子LaeA、途径特异性调控因子(含有锌指结构的转录调控因子)和表观遗传等。他们共同调控丝状真菌生长发育和次级代谢基因簇的表达。全局性调控因子LaeA是2004年在构巢曲霉中发现,它含有保守的甲基转移酶结合位点,且该保守位点和丝状真菌生长发育密切相关,可以促进基因簇的转录和翻译,从而调节丝状真菌次级代谢产物的合成。2008年在构巢曲霉中发现LaeA可以和VeA/VelB在细胞核内形成蛋白三聚体,调节构巢曲霉的生长发育和次级代谢。2013年,在构巢曲霉中,发现了LaeA同源的甲基转移酶LlmF,位于细胞质中,也可以和VeA/VelB在细胞质中形成三聚体,调节次级代谢和生长发育。LaeA和Lae A类似的甲基转移酶蛋白成为研究热点,研究方向更多的集中在甲基转移酶蛋白Llm调控丝状真菌的全局网络。橘青霉是美伐他汀产生菌,目前对于橘青霉次级代谢和生长发育的研究还比较少,基因组数据分析显示橘青霉中存在大量未知的次级代谢基因簇,其合成次级代谢的潜力还未被充分挖掘。本课题组已经报道了全局性调控因子LaeA、VeA正向调节橘青霉美伐他汀的生物合成,基因组测序获得橘青霉基因组序列框架图,但是在橘青霉中是否存在其他的甲基转移酶以及这些蛋白是否参与橘青霉次级代谢和生长发育的调节还未见报道。本课题在获得橘青霉基因组框架图的基础上,分析橘青霉基因组中潜在的甲基转移酶,成功获得9个含有adomet_mtases结构域的蛋白,并重点分析了llm3的功能。通过农杆菌和原生质体转化的方法获得了橘青霉llm3过表达和敲除菌株,探索llm3对橘青霉生长发育和次级代谢合成的影响。目的:利用农杆菌介导的转化和原生质体转化构建了橘青霉llm3过表达菌株(oe::llm3菌株)和llm3敲除菌株(Δllm3菌株),分析橘青霉oe::llm3菌株、Δllm3菌株和wt菌株之间菌落菌丝形态、孢子产量、美伐他汀产量等的差异,探究橘青霉中llm3对次级代谢和生长发育的影响。方法:1.提取橘青霉基因组,利用illuminahiseq测序技术,获得橘青霉基因组框架图;2.通过本地blast获得橘青霉中含有adomet-mtases结构域的蛋白,用进化树分析各蛋白之间同源关系,用rt-pcr获得橘青霉llm3的cdna序列,分析llm3蛋白质序列中的保守位点;3.在pyeu和pgihtgi载体的基础上构建敲除和过表达载体,所构建载体利用酶切和测序进行验证。将验证好的过表达质粒pgihtgi-llm3转入农杆菌lba4404中,通过潮霉素抗性筛选和pcr验证获得橘青霉llm3过表达菌株。利用原生质体将pyeu质粒中6.1kb的敲除片段转入橘青霉中,利用潮霉素抗性初筛和pcr验证获得敲除敲除菌株;4.通过菌落培养、显微镜观察和血球计数板计数分析wt菌株、oe::llm3菌株和Δllm3菌株在黑暗条件下的菌丝、菌落和孢子产量差异。利用rt-qpcr技术分析三株菌中孢子形成关键基因abaa和brla的转录差异;5.在pga培养基中发酵wt菌株、oe::llm3菌株和Δllm3菌株,通过hplc检测三株菌的美伐他汀产量,利用rt-qpcr技术分析美伐他汀合成基因簇中mlcr、mlcb的转录差异。结果:1.橘青霉基因组大小为31.34mb,一共有716个contigs;2.通过橘青霉本地blast,成功鉴定了橘青霉中9个甲基转移酶,生物信息学分析llm3的结构和功能;3.成功获得了oe::llm3和Δllm3菌株。4.llm3抑制橘青霉的无性繁殖。oe::llm3菌株的菌落颜色较浅,Δllm3菌株菌落颜色较深,oe::llm3菌株孢子产量较wt菌株少,而Δllm3菌株孢子产量较wt菌株多。oe::llm3菌株中分生孢子发育相关基因abaa和brla的表达量明显降低,Δllm3菌株中分生孢子发育相关基因abaA和brlA的表达量显著提高。5.llm3调控美伐他汀生物合成。在发酵第四天,WT菌株美伐他汀产量达到最大值,随后美伐他汀产量下降。而过表达llm3后,美伐他汀产量从第四天开始增加,且持续积累,一直到第八天,产量还处于上升趋势,llm3敲除后,美伐他汀产量和野生型趋势相似,但是比野生型低。结论:在橘青霉中,llm3参与调节橘青霉的生长发育和次级代谢,llm3抑制橘青霉无性发育过程,且正向调控美伐他汀生物合成。一方面,Llm3通过抑制分生孢子合成途径关键基因abaA和brlA的转录,从而抑制分生孢子的形成;另一方面,Llm3通过激活美伐他汀合成基因簇调控基因mlcR的转录促进合成基因的转录和表达。橘青霉中新的全局调控因子llm3对橘青霉生长发育和美伐他汀生物合成的研究有助于丰富橘青霉复杂的次级代谢调控途径及其机制的阐明。
[Abstract]:In this study , we found that LaeA and VeA / VelB can be used to regulate the growth and development of filamentous fungi . The effects of llm3 on secondary metabolism and growth and development of Penicillium citrinum were studied by means of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . Conclusion : In Penicillium citrinum , llm3 is involved in the regulation of growth and secondary metabolism of Penicillium citrinum , llm 3 inhibits the development of Penicillium citrinum and regulates the biosynthesis of mevastatin . On the one hand , Llm3 inhibits the formation of conidium by inhibiting the transcription of genes abaA and brlA .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915

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