激活素受体样激酶4,5和7抑制剂体外高通量筛选模型的构建

发布时间：2018-03-07 01:09

  本文选题：激活素受体样激酶　切入点：Bac　出处：《中国药理学与毒理学杂志》2017年06期 　论文类型：期刊论文

【摘要】：目的构建适于高通量筛选的激活素受体样激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制剂的筛选模型。方法利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建ALK4激酶结构域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,表达目的蛋白;通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和柱纯化,获得纯化的目的蛋白;分别以纯化的ALK4,ALK5,ALK7激酶片段与纯化的Smad3和ATP构建ALK4,ALK5,ALK7激酶活性测定体系,优化各反应底物浓度及反应条件,建立适于通量化分析的筛选模型;以已知ALK激酶抑制剂SB431542为工具分子,检测其对激酶的抑制活性,确证筛选模型的可靠性。结果经酶切和PCR鉴定,所得重组Bacmid均正确。转染Sf9昆虫细胞后纯化获得相应目的蛋白。经条件优化,反应体系中激酶和底物蛋白Smad3最佳浓度均为10 mg·L~(-1),ATP最佳初始浓度为10 nmol·L~(-1)。所得ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂筛选体系的Z′因子分别为0.71,0.51和0.74,符合高通量筛选要求。已知SB431542在所建模型上对ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分别为22,188和91 nmol·L~(-1)。结论成功构建了ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂的体外筛选模型。
[Abstract]:Objective to construct an ALK5 and ALK7 inhibitor screening model suitable for high throughput screening. Methods using the Bac to Bac baculovirus expression system, the viral expression systems of ALK4 kinase domain ALK4kd, ALK7kd, Smad2 and Smad3 proteins were constructed. Transfection of Sf9 insect cells, expression of target protein, purification of purified target protein by glutathione S-transferase (GST) affinity column, and construction of ALK4, ALK5, ALK7 kinase activity assay system with purified Smad3 and ATP, respectively. By optimizing the concentration and reaction conditions of each substrate, a screening model suitable for quantitative analysis was established, and the inhibitory activity of SB431542, a known inhibitor of ALK kinase, was tested. Results the recombinant Bacmid was confirmed by restriction endonuclease digestion and PCR. The target protein was purified by transfection of Sf9 insect cells. The optimum initial concentration of kinase and substrate protein Smad3 was 10 nmol 路L ~ (-1). The Z' factor of ALK4 / ALK5 and ALK7 kinase inhibitor screening system were 0.71 and 0.74, respectively, which met the requirement of high throughput screening. The results showed that the best initial concentration of SB431542 was 10 nmol 路L ~ (-1). The results showed that the best initial concentration of Smad3 was 10 nmol 路L ~ (-1), and the Z' factor of ALK4 / ALK5 and ALK7 kinase inhibitor screening system were 0.71 and 0.74, respectively. The inhibitory activity IC50 values of ALK4kd and ALK7kd were 22,188 and 91 nmol 路L ~ (-1), respectively. Conclusion the in vitro screening model of ALK4 / ALK5 and ALK7 kinase inhibitors was successfully constructed.
【作者单位】： 军事医学科学院毒物药物研究所;抗毒药物与毒理学国家重点实验室;北京师范大学生命科学学院;
【基金】：国家自然科学基金(81430090) 国家科技重大专项(2009ZX09501031);国家科技重大专项(2012ZX09301-003003)~~
【分类号】：R96

【参考文献】

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【共引文献】

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本文编号：1577273