石杉碱甲酶标纳米金探针检测方法的研究

发布时间：2018-03-07 03:14

本文选题：酶标纳米金探针　切入点：石杉碱甲　出处：《福建中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：石杉碱甲(HupA)是一种高效且可逆的乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,是目前治疗老年痴呆症(又称阿尔茨海默病,AD)最有前景的药物。随着世界人口老龄化的加快,阿尔茨海默病患者逐年增加,国内外对其需求量日益增加。当前医学界尚没有发现合适的HupA替代品,人工合成法也局限于实验室使用,目前HupA主要从石杉属和马尾杉属等植物中提取获得,然而该类植物野生资源匮乏,且HupA含量甚微。因此建立高灵敏度的HupA检测方法,对充分利用该类资源具有十分重要的现实意义。近年来,纳米技术发展迅速,尤其是纳米金标记技术备受业界关注。该技术具有简便、快速、准确及无毒等优点,为药物的分析测定提供一种新的研究思路。纳米金的表面积大、生物兼容性好,其表面能够通过静电作用与抗体、酶等生物大分子相结合,还可以与巯基或PolyA修饰的DNA相结合,形成探针后后生物分子的活性基本不受影响,且性质较为稳定,这些功能化的纳米金探针用于免疫分析中,可显著提高方法的检测灵敏度。免疫磁珠(磁珠探针)是近年来新兴的一种功能材料,指偶联了抗原或抗体的磁性微球。磁珠具有较强的磁响应性,通过引入磁场,可以实现快速分离、富集目标物,具有操作简便、快速高效和不影响生物活性等优点,在免疫分析领域、细胞分离等方面具有独特的优越性。本论文利用纳米金探针和磁珠探针的特性,以竞争免疫分析为基础,研发了检测HupA的新型酶标免疫分析方法,并应用于实际样品的含量测定,为药物中有效成分的微量测定提供新的分析策略。论文共分为三章,主要内容如下:第一章:酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。采用柠檬酸三钠还原法合成纳米金,将酶和抗体修饰于纳米金颗粒表面制备纳米金探针,并对探针制备条件进行优化,如标记pH、最适抗体标记量、酶和抗体标记比例等,采用紫外分光光度法和透射电镜对制备好的纳米金探针进行表征。将制备好的纳米金探针引入到免疫分析中,采用竞争免疫分析模式,建立了一种检测HupA的新方法。并对实验条件如包被抗原和纳米金探针稀释比例、最佳竞争反应时间进行了优化,在最佳实验条件下,该方法测定HupA的线性范围为0.5～150ng/mL,线性方程为1=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960),检测限为602.56 pg/mL。将该法应用于蛇足石杉中HupA含量测定,经国标法验证,二者测定结果基本一致,回收率在97.08～106.11%之间,结果较好。该法检测时间短,灵敏度高且重复性好,是一种简便、高效、经济的检测体系,有利于推广应用。第二章:磁珠和酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。本研究引入磁性载体-磁珠,代替传统的96孔酶标板,将石杉碱甲完全抗原(HupA-OVA)标记在磁珠上。基于磁性分离,利用纳米金探针,建立了快速、高效、灵敏度高的检测石杉碱甲的酶标免疫新方法。考察并优化了磁珠探针和纳米金探针的稀释比例、最佳竞争反应时间等免疫分析条件,最终确立了检测体系,在优化实验条件下,该方法在HupA浓度为0.075～180ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950),检测限为160.32 pg/mL。将该法应用于石杉碱甲片剂含量测定,检测结果与国标法所测结果基本一致,该方法的灵敏度较前一种方法更高、线性范围更宽且缩短了检测时间。第三章:磁珠和DNA-纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。在前两种方法研究的基础上,基于磁珠建立了 DNA-纳米金探针检测方法,并对该方法的精密度、重复性、专属性等进行了考察,结果均在允许范围内,该方法在HupA浓度为0.008～16 ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.3006 lgC+0.6142(r=0.9952)检测限为19.41pg/mL。并对蛇足石杉内生真菌发酵液中HupA进行了检测,加标回收率在99.33～103.73%之间,结果令人满意。DNA的引入进一步提高了方法的灵敏度,此方法较前两种方法灵敏度更高。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R927.1

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