酸碱修饰的柠檬果胶的分离纯化及其与半乳凝素-3相互作用的构效关系研究

发布时间：2018-03-08 21:08

  本文选题：柠檬果胶　切入点：RG-Ⅰ型果胶　出处：《东北师范大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：半乳凝素-3(galectin-3)是一种能够特异性识别并结合β-D-半乳糖苷的凝集素,在肿瘤发展转移过程中扮演着至关重要的角色,已成为研发抗肿瘤药物的靶分子之一。酸碱修饰的柠檬果胶(MCP)是将柠檬果胶经过酸碱处理后得到的产物。无论是体内实验还是体外实验,MCP均表现出较强的抗肿瘤活性。研究表明,galectin-3是MCP的靶分子。MCP通过和galectin-3结合,能够抑制galectin-3介导的肿瘤增殖和转移。虽然已有较多MCP活性方面的报道,但是关于MCP中的活性成分及其构效关系的研究几乎为零。因此,本文通过对MCP进行分离纯化、结构分析,并利用不同的方法对各级分进行活性检测,研究了MCP中抑制galectin-3的主要活性成分及其构效关系。研究成果如下:第一,为了全面系统地研究MCP中活性成分与galectin-3的相互作用,我们首先建立并比较了五种方法,用于研究galectin-3与其抑制剂之间的相互作用。结果表明,(1)生物膜干涉法(BLI)、表面等离子共振法(SPR)、荧光酶联免疫竞争抑制法(cFLISA)和红细胞凝集阻抑方法(G3H)均适用于研究果胶类抑制剂;(2)荧光偏振法(FP)和G3H法适用于检测小分子寡糖类抑制剂;(3)虽然各种方法得到的具体数值存在一定差异,但是抑制剂活性的强弱顺序基本一致;(4)每种方法都有各自的优缺点,利用多种方法得到的结果可信度较高。第二,本文利用DEAE-纤维素联合Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析,对MCP进行了分离纯化,并利用HPLC、HPGPC以及NMR对上述分离纯化后得到的各级分进行了结构分析。一共得到了4种酸性杂多糖级分(MCP-1、-2、-3、-4)和8种均一性较好的子级分(RG-Ⅰ型果胶:MCP-1a、MCP-2a、MCP-3Sa、MCP-4a;HG型果胶:MCP-2b、MCP-3Sb、MCP-3P、MCP-4b)。结构分析结果表明,RG-Ⅰ型果胶主要带有β-D (1→4)-galactan和α-L-(1→5)-arabinans或I型阿拉伯半乳聚糖聚糖支链。利用G3H法,研究了上述各级分的活性。结果表明,MCP-2的活性最强,约为MCP的10倍。带有β-D (1→4)-galactan支链的RG-Ⅰ型果胶的活性强于其它类型的RG-Ⅰ,并且大部分RG-Ⅰ型果胶的活性强于HG型果胶。另外,当酸性杂多糖级分MCP-2被进一步分成均一性较好的两种子级分(MCP-2a和MCP-2b)后,活性明显降低,即MCP-2a(RG-Ⅰ型果胶)和MCP-2b(HG型果胶)的活性均弱于母级分MCP-2。由此推测,RG-Ⅰ和HG可能存在协同抑制galectin-3的作用。第三,利用多种方法(包括G3H、cFLISA、BLI以及galectin-3诱导的T细胞凋亡实验),分别从分子水平和细胞水平上深入研究了MCP中RG-Ⅰ和HG型果胶的协同作用及其机制。在抑制galectin-3诱导的红细胞凝集和T细胞凋亡实验中,将MCP-2a(RG-Ⅰ)和MCP-2b、MCP-3P(HG)按照质量浓度比例分别为1:5和1:8混合时,能够展现出最强的协同活性;并且当二者按照上述比例混合时,利用BLI检测到混合物与galectin-3的作用强度明显强于二者加和的强度。随后,我们对二者产生协同作用的机制进行了研究,结果发现:(1)HG型果胶能够特异性结合galectin-3,并且不同聚合度的HG与galectin-3之间相互作用的强度不同,分子量约为5 kDa时,活性最强;(2)只有当HG的分子量不小于5 kDa时,才能展现出明显的协同活性;(3)HG能够减弱galectin-3自身的荧光强度,能够改变galectin-3分子内部色氨酸附近的微环境;(4)乳糖能够完全抑制MCP-2a与galectin-3之间的结合,而几乎不能抑制HG型果胶与galectin-3之间的结合,推测RG-Ⅰ型和HG型果胶结合在galectin-3的不同区域;(5)RG-Ⅰ和HG型果胶混合后,分子的平均粒径或空间构象发生了较为明显的变化,形成了一种新的缔合物协同作用于galectin-3。综上所述,本文将MCP进行了系统分离纯化,找到了MCP中结合galectin-3的活性成分,其中MCP-2的活性最强;除此之外,在这些活性成分中,RG-Ⅰ型与HG型果胶展现出协同抑制galectin-3的作用,同时对二者产生协同作用的机制进行了研究。上述研究结果,为MCP活性的研究提供了结构基础,对果胶类抗肿瘤药物的开发和应用具有重要的意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R979.1

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本文编号：1585548