转录因子Foxo3a在地西他滨诱导MDS细胞株SKM-1向单核细胞分化、凋亡、周期阻滞及自噬中的作用研究

发布时间：2018-03-10 16:53

  本文选题：Foxo3a　切入点：DAC　出处：《华中科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分地西他滨对MDS细胞株SKM-1形分化、周期、凋亡影响及对Foxo3a和其下游相关分子表达影响 研究目的： 1、明确低浓度DAC处理不同时间对SKM-1细胞分化、周期和凋亡的影响； 2、明确SKM-1细胞中Foxo3a及p-Foxo3a在DAC处理不同时间后的改变； 3、明确DAC处理不同时间对SKM-1细胞周期和凋亡相关蛋白p21、p27、C-MYC、Bim和FasL表达的影响。 研究方法： l、流式细胞术检测DAC处理不同时间后SKM-1细胞表面分子(CD14和CD11b)的动态变化； 2、流式细胞术检测DAC处理不同时间后SKM-1细胞周期动态变化； 3、Hochest33342和Annexin-V-FITC/PI双染法检测DAC处理0-6d后SKM-1凋亡改变； 4、Western Blot检测DAC处理不同时间后SKM-1细胞中Foxo3a、p-Foxo3a、p21、 p27、C-MYC、Bim和FasL表达情况。 结果： 1、DAC处理后对SKM-1细胞中粒系分化标记物CD11b表达无显著改变,但是可以增加单核细胞分化表面标记物CD14的表达； 2、DAC处理后SKM-1细胞中处于S期细胞比例降低,细胞阻滞于G0/G1和G2/M期； 3、DAC处理后,SKM-1细胞凋亡比例升高。DAC处理3d时早期和晚期凋亡细胞比例均升高,在第6d时,早期凋亡细胞升高幅度显著高于晚期凋亡细胞； 4、虽然SKM-1细胞中有Foxo3a表达,但是处于失活状态的p-Foxo3a水平较高,表明在SKM-1细胞中,Foxo3a处于失活状态。DAC处理可以增加SKM-1细胞中Foxo3a的水平,并降低p-Foxo3a,使Foxo3a/p-Foxo3a比值升高,活化Foxo3a的转录活性。SKM-1细胞中p21和p27表达微量,但是C-MYC表达较高,而DAC处理后可以导致p21和p27表达显著上调、C-MYC表达显著降低。此外DAC可以上调凋亡相关蛋白Bim,但是对FasL表达的影响不显著。 结论：DAC可以诱导SKM-1细胞向单核细胞分化,伴随细胞周期阻滞和细胞凋亡升高。DAC诱导SKM-1分化过程中伴随Foxo3a表达升高、p-Foxo3a降低,显示DAC可以诱导SKM-1细胞中Foxo3a活化,激活其对下游分子的转录活性。 第二部分Foxo3a在DAC诱导SKM-1细胞分化、周期、凋亡中的作用研究目的： 1、明确Foxo3a对SKM-1细胞分化、周期、凋亡的影响； 2、明确Foxo3a在DAC诱导SKM-1细胞分化、周期、凋亡中的作用； 研究方法： 1、使用siRNA短暂沉默SKM-1细胞中Foxo3a表达后,使用流式检测SKM-1细胞表面分子CD14和CD11b的变化及凋亡、周期改变,Western Blot检测相应分子表达变化； 2、DAC与Foxo3a siRNA联合处理SKM-1后,使用流式检测SKM-1细胞表面分子CD14和CD11b的变化及凋亡、周期改变,Western Blot检测相应分子表达变化。 结果： 1、短暂沉默SKM-1细胞中Foxo3a表达后对SKM-1细胞表面标记物CD14、CD11b表达、周期和凋亡无明显影响,但是Western Blot检测结果显示,Foxo3a短暂沉默后与周期相关的p21、p27蛋白和与凋亡相关的Bim蛋白表达均降低,原癌蛋白C-MYC表达上调； 2、DAC与Foxo3a siRNA联合处理后可以部分逆转DAC单独应用所诱导的SKM-1细胞单核细胞分化、周期阻滞和凋亡诱导效应,此过程伴随p21、p27和凋亡相关蛋白Bim表达改变,但是对C-MYC无明显影响。 结论： Foxo3a活化参与了DAC诱导的SKM-1细胞向单核细胞分化、周期阻滞和凋亡诱导效应,活化诱导的靶基因p21、p27和Bim蛋白表达上调可能与此相关。 第三部分Foxo3a在地西他滨诱导MDS细胞株SKM-1自噬中的作用 研究目的： 1、明确DAC处理对SKM-1细胞自噬水平及自噬相关蛋白Atg12、Atg16、Atg5和自噬调控蛋白Belcinl表达影响; 2、明确Foxo3a对SKM-1细胞中自噬及其相关蛋白表达的关系及在DAC诱导SKM-1细胞自噬中的作用。 研究方法： 1、Western Blot检测DAC处理不同时间段SKM-1细胞中自噬标记蛋白LC3和自噬相关蛋白Atg12、Atg16、Atg5、自噬调控蛋白Belcinl表达水平； 2、SiRNA干扰Foxo3a后观察Foxo3a表达下调在SKM-1细胞自噬中的作用； 3、Foxo3a siRNA与DAC联合处理SKM-1细胞后观察SKM-1细胞中自噬标记蛋白LC3和自噬相关蛋白Atg12、Atg16、Atg5及自噬调控蛋白Belcinl表达水平改变。 结果： 1、DAC处理诱导SKM-1细胞中自噬标记蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达升高及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高；此外,自噬相关蛋白Atg12、Atg16、Atg5和自噬调控蛋白Belcinl在DAC处理后均升高,说明DAC可以上调SKM-1细胞自噬水平； 2、SiRNA干扰SKM-1细胞中Foxo3a表达可以下调LC3蛋白表达,其中对LC3-I下调作用比LC3-II明显,此过程伴随Atg12、Atg16Atg5和Belcin1蛋白表达降低； 3、Foxo3a siRNA与DAC联合处理可以降低DAC单独使用所诱导的自噬及自噬相关蛋白表达。 结论： DAC诱导SKM-1细胞中与自噬诱导相关的Belcinl及自噬成核、延伸相关的Atg5、Atg12、Atg16蛋白表达上调、促进细胞自噬水平升高,此过程与转录因子Foxo3a表达上调及活化有关。
[Abstract]:The effect of SKM-1 differentiation, cycle, apoptosis and the influence on the expression of Foxo3a and its downstream related molecules in the first part of the MDS cell line
The purpose of the study is:
1, the effect of low concentration of DAC on the differentiation, cycle and apoptosis of SKM-1 cells at different time was determined.
2, the changes of Foxo3a and p-Foxo3a in SKM-1 cells were determined after different time of DAC treatment.
3, the effect of DAC treatment on the expression of SKM-1 cell cycle and apoptosis related protein p21, p27, C-MYC, Bim and FasL at different time was determined.
Research methods:
L, flow cytometry was used to detect the dynamic changes in the surface molecules of SKM-1 cells (CD14 and CD11b) after DAC treatment at different time.
2, flow cytometry was used to detect the dynamic changes of SKM-1 cell cycle after DAC treatment at different time.
3, Hochest33342 and Annexin-V-FITC/PI double staining were used to detect the apoptosis of SKM-1 after DAC treatment for 0-6d.
4, Western Blot detected the expression of Foxo3a, p-Foxo3a, p21, p27, C-MYC, Bim and FasL in SKM-1 cells after different times of DAC treatment.
Result锛，

本文编号：1594232