一种新的基于FRET技术和流式细胞分析的细胞凋亡诱导剂药物筛选系统
本文选题：抗肿瘤药物 切入点：流式细胞术 出处：《南京大学》2014年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：从自然界或人工合成的分子库中筛选细胞凋亡抗肿瘤候选药物迄今仍然一个步骤繁杂的实验,而且实验对设备仪器要求较高。本论文研究将流式细胞仪的荧光信号检测功能和蛋白酶类荧光共振能量转移技术(FRET)相结合、设计了较方便用以细胞凋亡抗肿瘤药物高通量筛选的FRET荧光探针。其主要原理是：通过测定荧光蛋白之间的FRET现象来检测在药物作用下、肿瘤细胞内中分别位于两种细胞凋亡途径中的关键酶casp-8和casp-2的活性,以期用以确定所筛选的化合物是否能够通过激活这两种酶而引发肿瘤细胞的凋亡。将基于荧光显微镜技术的FRET方法与成熟的流式细胞术相结合,能够实现本论文中筛选技术的快速、准确和高通量应用。本论文研究利用我们所搭建的流式细胞分析系统和作用机制的已知细胞凋亡诱导药物,对本文设计的三色FRET探针EBFP2-C8-EGFP-C2-TagRFP进行了测定和验证,实验结果证明了本文设计和构建的探针能够分别、独立地检测细胞内casp-8、casp-2的活性,同时将casp-8、 casp-2的活性表现为FRET效率的变化。论文通过caspase抑制剂,对所设计检测探针酶活性测定的有效性以及其与FRET效率的关联性进行了验证。本论文工作为新的基于流式细胞仪分析平台、用于细胞凋亡抗肿瘤药物筛选的FRET荧光探针奠定了理论与实验基础。
[Abstract]:The screening of apoptotic antitumor drugs from nature or synthetic molecular banks is still a complicated experiment. In this paper, the fluorescence signal detection function of flow cytometry is combined with the fluorescence resonance energy transfer technique of protease. A FRET fluorescence probe was designed for high throughput screening of apoptosis antitumor drugs. The main principle of this probe was to detect the FRET phenomenon between fluorescent proteins. The activities of casp-8 and casp-2, which are the key enzymes in two kinds of apoptosis pathway in tumor cells, respectively. In order to determine whether the selected compounds can trigger apoptosis of tumor cells by activating the two enzymes, the FRET method based on fluorescence microscopy is combined with mature flow cytometry. In this paper, we study the known apoptosis-inducing drugs based on the flow cytometry analysis system and the mechanism of cell apoptosis, which can be used in this paper to realize the rapid, accurate and high-throughput application of the screening techniques. The EBFP2-C8-EGFP-C2-TagRFP of the three-color FRET probe designed in this paper was measured and verified. The experimental results show that the designed and constructed probes can independently detect the activity of casp-8 casp-2 in cells. At the same time, the activity of casp-8, casp-2 showed the change of FRET efficiency. The validity of the enzyme activity of the probe and its correlation with the efficiency of FRET were verified. The work of this paper is based on a new flow cytometry (FCM) analysis platform. The FRET fluorescent probe used for screening anti-tumor drugs laid a theoretical and experimental foundation.
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R91
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，本文编号：1636387
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