星形胶质细胞产生的Hepcidin参与了LPS诱导的神经元铁代谢紊乱和凋亡

发布时间：2018-03-23 17:35

本文选题：LPS　切入点：Hepcidin　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：铁是人体必需的微量元素之一，正常的脑铁水平对脑的发育及生理功能的维持极为重要。脑铁代谢存在着严格的调节机制，但是在炎症等病理情况下，脑铁代谢发生明显的改变。铁调素（Hepcidin）是由肝脏合成并分泌的抗菌肽，其在外周铁稳态调节中发挥关键作用。尽管hepcidin主要在肝脏合成，但在鼠类脑部多个脑区也检测到hepcidin的表达。Hepcidin在神经组织的定位和功能特性提示其在维持脑部铁稳态中发挥重要作用。然而，内源性hepcidin对神经元铁代谢的影响以及在LPS诱导的神经元凋亡中的作用尚未阐明。本研究探讨小胶质细胞和星形胶质细胞以及内源性hepcidin在LPS诱导的神经元凋亡中的作用及机制，为进一步增加对脑铁代谢调控分子机制的认识和内源性hepcidin在LPS诱导的神经元凋亡中的作用提供依据。方法： 1大鼠神经细胞的原代培养、纯化和鉴定 1.1大鼠皮质神经元细胞的原代培养：取孕（E16-E18）SD大鼠处死后，取出胎鼠，分离双侧大脑顶层皮质后加入到木瓜蛋白酶中（2mg/ml）37℃消化30分钟；将组织用进口枪头（口径1mm）吹打（约10次），吸出上层单细胞悬液，重复上述操作两次，将总的细胞悬液混匀。将细胞悬液以1×105/cm2的密度种入预先经多聚赖氨酸处理的爬片的24孔培养板和预先铺好多聚赖氨酸的6孔细胞培养板中，6-8h后，换成神经元培养基Neurobasal，2%B27，以后每3天换半液。 1.2混合胶质细胞的原代培养：取24小时内出生的SD乳大鼠，断头处死，取全脑分离双侧大脑顶层皮质后加入到木瓜蛋白酶中（2mg/ml）37℃消化30分钟；用进口枪头（口径1mm）吹打（约10次），静置2min后，吸出上层单细胞悬液，重复上述操作两次，将总的细胞悬液混匀。将单细胞悬液以1×105/cm2的密度种入预先经多聚赖氨酸处理的75cm2培养瓶中，根据细胞代谢情况，每2～3天换液1次。 1.3星形胶质细胞和小胶质细胞的纯化星形胶质细胞：原代混合胶质培养9-10d，待细胞融汇并形成明显分层，振荡摇晃18～20h,用无血清DMEM漂洗后，加入胰酶消化下贴壁的扁平的星形胶质细胞，接种在6孔板和24孔板培养板中，加入完全培养基，37℃，5%CO2恒温培养箱培养，每2～3天换液1次。小胶质细胞：原代混合胶质培养9-11d后,待细胞融汇并形成明显分层，振荡摇晃2h分离小胶质细胞，收集悬液以1000r/min离心7min，弃上清，加定量完全培养液再次吹打成细胞悬液，以1×105/cm2的密度接种于多聚赖氨酸预先处理的6孔板和24孔板中，置入37℃5%CO2恒温培养箱30min后取出，完全换液1次，以去除未贴壁细胞。 1.4细胞纯度鉴定取出不同方法处理后的细胞爬片，免疫细胞化学和免疫荧光方法鉴定细胞纯度。 2采用Hoechst33258荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，MTT比色法，流式细胞术实验检测大鼠皮层神经元凋亡的情况。 3Western-blot方法检测铁转运相关蛋白Tfr1、DMT1、Ferroportin1（Fpn1）、Ferritin H、Ferritin L在神经元的表达变化。 4RT-PCR方法检测IL-6，hepcidin mRNA在不同神经细胞中的表达情况。结果： 1三种神经细胞的形态学观察结果 1.1原代皮层神经元的培养倒置相差显微镜下观察，细胞培养6h基本贴壁，体积小，立体感强，圆而透亮，极少数细胞伸出细小的短突起。1d后大部分细胞长出突起，胞体呈圆形或椭圆形，饱满，光晕明显。4-6d胞体明显增大，且开始聚集，突起相连呈网状样生长。NeuN抗体染色阳性，阳性细胞纯度95%。 1.2混合胶质细胞的培养倒置相差显微镜下观察，细胞培养的1-2d，胶质细胞数量和形态没有较大变化，但神经元数目逐渐减少；细胞培养的3-4d，星形胶质细胞数量明显增多，胞体铺展，逐渐成层。神经元死亡加速，细胞崩解产物增多；细胞培养的第5-6d开始出现分层生长，下层细胞为胞体较大、扁平、折光性较差的星形胶质细胞；上层为体积较小、圆形的小胶质细胞；在小胶质细胞间会发现一些有细小突起的圆形细胞，与小胶质细胞相比，胞体较小，折光均匀，边缘光滑，突起多为双极状，细胞分布不均，或呈葡萄串样聚集分布，可能是少突胶质细胞系；细胞培养的第9-11d分层更加明显，培养11d后，星形胶质细胞和小胶质细胞的数量和形态变化不明显，其它细胞如少突胶质细胞数目则明显增加。 1.3星形胶质细胞的培养原代混合胶质细胞培养9-10d，待细胞融汇并形成明显分层，振荡摇晃18～20h,用无血清DMEM漂洗3次，加入0.125%胰酶消化下保留的贴壁的扁平细胞，接种在6孔板和24孔板培养板中。GFAP抗体染色阳性，阳性细胞纯度95%。 1.4小胶质细胞的培养原代混合胶质细胞培养9-11d，摇床振荡2h分离小胶质细胞。小胶质细胞多在30min内贴壁，30min后换液，去除未贴壁细胞。小胶质细胞在形态上多为圆形，边缘不规则，培养的第2d可见细胞胞体回缩，少量细胞伸出突起，多为单极，培养3-4d后，可见大多细胞转为静止状态，胞体狭长，伸出突起。CD11b抗体染色阳性，阳性细胞纯度98%。 2小胶质细胞和星形胶质细胞共同参与了LPS诱导的神经元凋亡过程收集LPS处理小胶质细胞24h的条件培养基，即为CM1；收集CM1处理星形胶质细胞的条件培养基，即为CM3。 2.1Hoechst33258染色检测神经元凋亡情况以hoechst33258染色，激光共聚焦显微镜观察，与对照组相比，LPS处理神经元6h后，神经元的凋亡率无明显变化；CM1处理神经元6h，神经元的凋亡率为20.9%，与对照组相比无显著差异；CM3处理神经元6h，神经元凋亡率明显加剧，达到36.7%（P0.01）。 2.2MTT方法检测神经元细胞活力与对照组相比，LPS处理神经元6h，细胞活力未见明显变化；以CM1处理神经元6h，神经元活力亦未见明显下降；以CM3处理神经元6h，神经元活力明显下降（P0.01）。 2.3流式细胞术实验检测神经元凋亡情况与对照组相比， LPS处理神经元6h后，神经元的凋亡率无明显变化；CM1处理神经元6h，神经元的凋亡率为5.65%，与对照组相比有差异；CM3处理神经元6h，神经元凋亡率为22.6%，与对照组相比，显著升高。CM3处理组与CM1处理组相比，凋亡率明显升高，有统计学差异（P0.01）。 3铁含量及相关蛋白的变化 3.1铁含量测定本实验采用ICP-MS方法检测了不同处理后神经元内的铁含量。结果显示，LPS处理神经元6h后，神经元内铁含量不增加；CM1处理神经元6h后，神经元内铁含量也未见显著增加；CM3处理神经元6h后，神经元内铁含量显著增加（P0.01）。提示LPS诱导神经元凋亡可能与增加神经元内铁含量有关，且小胶质细胞和星形胶质细胞均参与了这一过程。 3.2Tfr1的变化与对照组相比，LPS处理神经元6h，Tfr1蛋白无明显变化；CM1处理组Tfr1蛋白的表达上调18.3%（P＜0.01），CM3处理组Tfr1蛋白的表达上调35.8%（P＜0.01），有显著统计学差异。 3.3Fpn1的变化与对照组相比，LPS处理处理神经元6h，Fpn1蛋白无明显变化；CM1处理组Fpn1蛋白下调6.52%（P＜0.05），CM3处理组Fpn1蛋白下调25.4%（P＜0.01），有统计学差异。 3.4DMT1的变化与对照组相比，LPS处理神经元6h，DMT1蛋白无明显变化；CM1处理组DMT1蛋白上调26.3%（P＜0.001），CM3处理组DMT1蛋白上调119.5%（P＜0.001），有显著统计学差异。 3.5H/L-Ferritin的变化与对照组相比，LPS处理神经元6h，H-Ferritin蛋白无明显变化，CM1处理组H-Ferritin蛋白上调27.8%（P＜0.001），CM3处理组H-Ferritin蛋白上调72.4%（P＜0.001），有显著统计学差异。与对照组相比，LPS处理神经元6h，L-Ferritin蛋白无明显变化，CM1处理组L-Ferritin蛋白上调22.9%（P＜0.001），CM3处理组L-Ferritin蛋白上调68.9%（P＜0.001），有显著统计学差异。 4LPS通过激活小胶质细胞释放IL-6诱导星形胶质细胞表达hepcidin 4.1LPS诱导hepcidin表达的神经细胞类型对照组三种神经细胞hepcidin mRNA的基础表达量均非常低，LPS（100ng/ml）处理三种神经细胞24h后，hepcidin mRNA的表达均无明显变化。 4.2IL-6对三种神经细胞hepcidin mRNA表达的影响 IL-6（10ng/ml）处理三种神经细胞24h后，星形胶质细胞hepcidinmRNA的表达明显升高，神经元和小胶质细胞hepcidin mRNA的表达没有明显变化。 4.3LPS对三种神经细胞IL-6mRNA表达的影响 LPS处理小胶质细胞24h，IL-6mRNA的表达明显升高，星形胶质细胞IL-6mRNA也有升高，但远低于小胶质细胞，而在神经元未检测出IL-6mRNA的表达。 4.4CM1和IL-6分别处理星形胶质细胞24h，星形胶质细胞hepcidinmRNA表达均明显升高；在CM1中加入抗IL-6的抗体，再处理星形胶质细胞24h，则星形胶质细胞中hepcidin mRNA表达的作用受到显著抑制。 5敲除hepcidin后对神经元铁含量及铁相关蛋白的影响由于纯化的星形胶质细胞与C6对处理无差别，因此用C6代替了纯化的星形胶质细胞。将shHepcidin-慢病毒感染C6，封闭内源性hepcidin表达，shCtrl-慢病毒感染C6作为对照。以IL-6处理C624h后收集条件培养基，即为CM2′；IL-6处理shCtrl-病毒感染的C624h，收集条件培养基，即为CM2′(+); IL-6处理shHepcdin-病毒感染的C624h，收集条件培养基，即为CM2′(-)。然后分别以IL-6、CM2、CM2′(+)或CM2′(-)处理神经元6h，测定神经元内铁含量及铁相关蛋白的变化。 5.1铁含量的变化与对照组相比，IL-6处理组神经元内铁有所升高，，但无显著差异，CM2′、CM2′(+)处理组神经元铁含量显著升高；与CM2′(+)处理组相比，CM2′(-)处理组神经元内铁含量显著下降。说明敲出星形胶质细胞hepcidin可抑制IL-6诱导的神经元铁含量增加，提示星形胶质细胞hepcidin是炎症诱导神经元铁增加的关键因素。 5.2Tfr1的变化与对照组相比，IL-6处理组和CM2处理组Tfr1蛋白分别上调39.4%（P＜0.01）和69.7%（P＜0.01），有显著统计学差异。与CM2′处理组相比，CM2′(-)处理组Tfr1蛋白下调39.6%（P＜0.001），CM2′(+)处理组无明显变化。 5.3Fpn1的变化与对照组相比，IL-6处理组和CM2处理组Fpn1蛋白分别下调12.9%（P＜0.05）和37.3%（P＜0.05），有统计学差异。与CM2′处理组相比，CM2′(-)处理组Fpn1蛋白上调124.4%（P＜0.001），CM2′(+)处理组Fpn1蛋白上调30.1%（P＜0.001），有显著统计学差异。 5.4DMT1的变化与对照组相比，IL-6处理组和CM2处理组DMT1蛋白分别上调17.1%（P＜0.05）和39.6%（P＜0.05），有统计学差异。与CM2′处理组相比，CM2′(-)处理组DMT1蛋白下调62.3%（P＜0.001），CM2′(+)处理组DMT1蛋白下调27.1%（P＜0.01），有显著统计学差异。 5.5H/L-Ferritin的变化与对照组相比，IL-6处理组和CM2处理组H-Ferritin蛋白表达无统计学差异。与CM2′处理组相比，CM2′(-)处理组H-Ferritin蛋白下调62.3%（P＜0.001），CM2′(+)处理组H-Ferritin蛋白下调19.3%（P＜0.05），有统计学差异。与对照组相比，IL-6处理组和CM2处理组L-Ferritin蛋白表达无统计学差异。与CM2′处理组相比，CM2′(-)处理组L-Ferritin蛋白上调160.0%（P＜0.05），CM2′(+)处理组L-Ferritin蛋白上调71.3%（P＜0.05），有统计学差异。 6敲除hepcidin后皮层神经元凋亡率的变化以hoechst33258荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，与对照组相比，IL-6处理神经元6h，神经元凋亡率未见明显增加，CM2处理组凋亡率明显升高（P＜0.01）。与CM2′处理组相比，CM2′(-)处理神经元6h后，神经元凋亡率显著下降。结论： 1小胶质细胞和星形胶质细胞均参与了LPS诱导的神经元凋亡过程； 2LPS诱导的神经元凋亡与增加神经元内铁含量有关； 3LPS诱导小胶质细胞表达和释放IL-6，继而诱导星形胶质细胞表达hepcidin； 4星形胶质细胞产生的hepcidin通过抑制神经元铁输出增加神经元内铁含量； 5星形胶质细胞产生的hepcidin引起的铁增加是LPS导致神经元凋亡的因素。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965

【参考文献】