靶向转录调控关键蛋白BRD4和Menin的小分子抑制剂的发现和作用机制研究

发布时间：2018-03-30 23:25

本文选题：表观遗传学　切入点：组蛋白乙酰化　出处：《中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)》2017年硕士论文

【摘要】：表观遗传学研究的是表观基因组在调节的过程中表达水平及功能变化的生命现象和生理过程,这一过程包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。表观遗传调节的过程并不依赖于DNA序列的改变,因此,表观遗传学也可以定义为不依赖于DNA序列改变的任何一种潜在的、稳定的、可遗传的基因表达的变化。科学的飞速发展解释了生命体的复杂性,在人类实现了基因组测序之后,表观遗传学已经成为了生命研究领域的重要研究方向。表观遗传对基因表达的调节一般分为:(1)选择性基因表达调节,包括DNA甲基化、组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化;(2)基因转录后调节,包括siRNA和miRNA。组蛋白重组,基因写入及组蛋白失活也属于表观遗传学的范畴。BET蛋白家族属于BRD蛋白家族,主要包括BRD2,BRD3,BRD4和BRDT。BRD蛋白家族参与了组蛋白赖氨酸乙酰化的识别,而这一过程是组蛋白乙酰化参与表观遗传调控的关键步骤。其中,随着JQ-1和IBET等小分子抑制剂的发现,BRD4作为BET蛋白家族中最具研究潜能的蛋白而备受研究者们的欢迎。BRD4包含了BRD4(1)和BRD4(2)两个结构域,其中BRD4(1)在血液病肿瘤模型中发挥主要的作用。有研究表明,在血液病肿瘤中,BRD4能通过下调基因c-Myc从而抑制肿瘤的发生和发展。针对BRD4的靶点,我们筛选了实验室含有2000个化合物的化合物库,Alphascreen实验初筛得到了一些有活性的小分子抑制剂,分子水平上经过蛋白热迁移实验确证之后得到了活性较好的小分子DC-BD-03,Alphascreen测出其IC50值为2.01μM,蛋白热迁移实验也显示该化合物能与BRD4蛋白结合且有浓度依赖。另外DC-BD-03的衍生物DC-BD-29与BRD4_BD1的复合物晶体衍射及分析结果更确证了其靶向性。DC-BD-03对癌细胞MV4;11有增殖抑制活性,且能引起癌细胞G1/S期周期阻滞,诱导癌细胞凋亡。另外,qPCR结果显示DC-BD-03能抑制下游靶基因的表达,western结果也显示了对下游靶基因在翻译水平的抑制活性。我们筛选出来的化合物是一类三甲氧基环类化合物,从已有的数据看出,筛选出的化合物活性还不是很好,结构还需要进一步改造,动物实验等还有待进一步探索。另外,我们在研究蛋白-蛋白相互作用(PPIs:protein-protein interactions)的过程中,也有研究指出了BRD4与组蛋白相互作用的这一实例。在2010年的一篇Nature中,Bradner和其同事报道了小分子能阻断BRD4和组蛋白的相互作用,从而为“PPI抑制剂能够在表观遗传调控中发挥重要作用”这一理论提供了有利的现实根据。我们实验室所研究的menin蛋白与MLL相互作用的课题即为PPI的典型案例。在患有急性髓性白血病和急性淋巴性白血病的患者中以及在治疗白血病及骨髓异质增生综合征等相关疾病的过程中,人们发现MLL基因在在染色质上出现了异位的现象,因此引发了人们的进一步猜想:MLL基因的异位是导致这些血液病的重要原因。MLL基因可以和多种因子融合,比如AF4,AF9和ENL等,其中,menin是MLL的重要辅因子之一。Menin与MLL的相互作用对白血病的形成至关重要,因此靶向menin与MLL的相互作用为开发和改造新型抗肿瘤药提供了新思路。随着menin与MLL相互作用的晶体复合物结构的研究,进一步解释了menin与MLL相互作用的结合机制,并且鉴定出了最主要的两个结合基序MBM1以及MBM2。其中研究比较深入的是MBM1,也是在相互作用的过程中起主要作用的区域。就目前的研究背景,开发靶向menin-MLL相互作用的新型骨架的小分子势在必行。我们实验室对含有20000个小分子的化合物库进行了筛选,以FP实验方法进行了初筛和复筛,并以蛋白热迁移的实验方法进行了确证,在细胞水平上分别选用了MLL融合的血液病细胞MV4;11和KOPN-8进行增殖抑制实验,结果显示对细胞的增值抑制活性特别好,当然选择性和靶向性还有待进一步确证。为了更直观更明确地确证小分子对menin蛋白的靶向性,我们正在进行menin及menin与小分子的复合物晶体的探究,我们参考现有文献构建并获得了用于结晶的menin截短体序列,结晶条件正在摸索阶段,后期还会尝试更多的menin截短体的结晶尝试。
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【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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