羧胺三唑有效缓解小鼠过敏性气道炎症以及与地塞米松联合用药效果的初步探究

发布时间：2018-04-02 16:00

本文选题：过敏性气道炎　切入点：羧胺三唑　出处：《北京协和医学院》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景哮喘是一种慢性气道炎症,涉及多种炎性细胞和炎症介质。近年来随着空气污染加重,哮喘的发病率亦呈现上升的趋势。糖皮质激素类药物是目前治疗该疾病的最有效药物,但少数患者对糖皮质激素存在抵抗,治疗效果不理想,且长时间使用糖皮质激素还会产生一定的耐药性及药物依赖性。因此,我们亟需寻找有效的替代方法来预防和治疗这种气道炎性疾病[1-2]。狻胺三唑(Carboxyamidotriazole,CAI)是一种非细胞毒类抗肿瘤药物,为人工合成小分子化合物。能够抑制细胞外钙离子内流,早期表现出良好的抑制肿瘤增殖和转移的作用。近几年,本课题组通过研究发现,CAI还具有良好的抗炎作用,对急、慢性炎症均有良好的抑制作用[3-4]。且本课题组研究发现,CAI是一种非选择性的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂,通过非选择性地抑制各亚型PDEs,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的产生,从而发挥抗炎作用。在PDEs家族中,PDE4主要表达于炎症细胞、平滑肌、大脑等组织中,与炎症的发生有着密切的关系[5]。综上,我们提出假设:羧胺三唑(CAI)能否在过敏性气道炎中起到较好的治疗作用,且是否是通过抑制PDE4的表达发挥作用的;若以上假设成立,如何将CAI的抗炎效果与现有的药物结合,使治疗效果发挥最佳。研究方法1.羧胺三唑对大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)分泌炎症因子的影响及潜在靶点的研究实验分为正常组(CON)、激发组(LPS)、20μMCAI低剂量治疗组(CAI20)、40μM CAI高剂量治疗组(CAI40)、地塞米松阳性药对照组(DEX)。使用脂多糖(LPS)诱导激发大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383),分别检测激发后24h及48h细胞培养基中IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌水平。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NR8383细胞中PDE-4B表达水平。2.羧胺三唑对小鼠过敏性气道炎症的治疗作用及潜在靶点的研究使用OVA诱导致敏激发的方法建立OVA过敏性气道炎症模型,模型建立周期为28天。实验动物分为正常组(CON)、模型组(OVA)、20mg/kg CAI低剂量治疗组(CAI20)、40mg/kgCAI高剂量治疗组(CAI40)、地塞米松阳性药对照组(DEX)。使用肺功能仪检测气道高反应性;取肺泡灌洗液(BALF),酶联免疫法(ELISA)检测其中IL-4、IL-13、IFN-γ水平;细胞计数及瑞氏-吉姆萨染色检测BALF中总细胞数和嗜酸性粒细胞数;心脏取血得到血清,ELISA法检测血清中IgE水平;取左肺固定后,进行肺组织切片,HE染色后观察肺组织病理水平改变,PAS染色后观察气道黏液分泌情况。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肺组织中PDE-4A、PDE-4B 及 PDE-4D 表达水平。3.羧胺三唑联合地塞米松对小鼠过敏性气道炎症的治疗作用实验分为正常组(CON)、模型组(OVA)、40mg/kgCAI治疗组(CAI40)、0.25mg/kg低剂量地塞米松治疗组(DL)、0.5mg/kg高剂量地塞米松治疗组(DH)、0.25mg/kg低剂量地塞米松联合20mg/kgCAI治疗组(DL20)、0.25mg/kg低剂量地塞米松联合40mg/kgCAI治疗组(DL40)。建立过敏性哮喘模型,取BALF,ELISA法检测其中IL-4、IL-13、IFN-γ水平;细胞计数及瑞氏-吉姆萨染色检测BALF中总细胞数和嗜酸性粒细胞数;心脏取血得到血清,ELISA法检测血清中IgE水平;取左肺固定后,进行肺组织切片,HE染色后观察肺组织病理水平改变。研究结果1.羧胺三唑对大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)分泌炎症因子的影响及潜在靶点的研究1.1.1μg/ml的LPS能够成功诱导NR8383分泌致炎因子(P0.01)。1.2.给药24h后收样,发现与正常组相比,LPS诱导组分泌IL-1β量显著增加(P0.01)。与诱导组相比,CAI20组细胞IL-1β分泌量显著降低(P0.05),CAI40组与DEX组细胞IL-1β分泌量显著降低(P0.01)。1.3.给药24h和48h后,LPS诱导组分泌IL-6和TNF-α量显著增加(P0.001),与诱导组相比,治疗组分泌IL-6和TNF-α量均显著下降(P0.001)。1.4.与正常组相比,LPS诱导组细胞中PDE-4B的mRNA表达量显著增加(P0.001)。与诱导组相比,CAI治疗组细胞中PDE-4B的mRNA表达量均显著下降(P0.001),说明CAI是PDE-4B的抑制剂。2.羧胺三唑对小鼠过敏性气道炎症的治疗作用及潜在靶点的研究2.1.卵清蛋白致敏激发的方法可以成功地建立小鼠过敏性气道炎症模型,主要表现为小鼠气道高反应性变化明显,炎症细胞分化聚集,致炎因子分泌增多,支气管平滑肌增厚,肺组织病理结构明显变化等。2.2.使用肺功能仪检测小鼠气道高反应性变化时,给予20mg/ml浓度的乙酰胆碱溶液刺激时,与正常组小鼠相比,模型组小鼠气道阻力显著升高(P0.001),气道动态顺应性显著降低(P0.01)。与模型组小鼠相比,CAI40组小鼠的气道阻力变化显著回落(P0.01),气道动态顺应性显著回升(P0.05),CAI20组小鼠的气道阻力也有所下降,气道动态顺应性也有所回升,但与模型组小鼠相比无明显差异。2.3.计算肺泡灌洗液中总细胞数和嗜酸性粒细胞比例结果显示,与正常组小鼠相比,模型组小鼠BALF中总炎症细胞数及嗜酸性粒细胞数均显著增加(P0.001)。与模型组小鼠相比,CAI40组小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞总数下降显著(P0.01),嗜酸性粒细胞比例也显著下降(P0.001)。而与模型组小鼠相比,CAI20组小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例明显下降(P0.01)。2.4.ELISA检测小鼠肺泡灌洗IL-4、IL-13水平,与正常组小鼠相比,模型组小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13含量显著增加(P0.001),CAI20组会显著降低BALF中IL-4的含量(P0.01),CAI40组会也显著降低BALF中IL-4及 IL-13 含量(P0.01)。2.5.ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量显著降低(P0.001),而CAI40组可显著缓解IFN-γ含量的下降(P0.001)。2.6.ELISA检测小鼠血清中总IgE含量及OVA特异型IgE含量发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠血清中两种IgE含量均明显上升(P0.001),说明该模型是一个很严重的过敏反应。而与模型组小鼠相比,CAI40组可明显降低两种IgE含量(P0.01)。2.7.通过肺组织HE染色发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠的支气管壁上皮明显增厚、脱落,支气管平滑肌增厚,杯状细胞增生明显,病理评分指数显著升高(P0.001)。与模型组小鼠相比,CAI20组小鼠的气道重塑现象有所缓解(P0.01),但不十分明显。而CAI40组及DEX组小鼠的气道重塑现象明显缓解,两组小鼠均未见明显的气道上皮及平滑肌增厚,亦未见明显的杯状细胞增生,气道周围炎症细胞分泌聚集明显减少,病理评分指数亦显著下降(P0.001)。2.8.通过PAS染色发现,与正常组相比,模型组小鼠肺泡中黏液分泌明显增多,而CAI40组及DEX组小鼠肺泡中黏液分泌显著减少。2.9.通过RT-qPCR检测小鼠肺组织PDE4各亚型表达量发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠肺组织中PDE-4A和PDE-4D表达量显著增加(P0.05),而与模型组相比,CAI40组小鼠肺组织中PDE-4A和PDE-4D表达量显著下调(P0.05)。与正常组小鼠相比,模型组小鼠肺组织中PDE-4B的表达量显著增加(P0.001),而CAI20组和CAI40组小鼠肺组织中PDE-4B的表达量均明显下调(P0.05)。由此可见CAI是PDE4的抑制剂。3.羧胺三唑联合地塞米松对小鼠过敏性气道炎症的治疗作用3.1.ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平发现,与模型组相比,合用组(DL20组、DL40组)均可显著降低升高的小鼠BALF中IL-4、IL-13含量(P0.001),而且DL20组的治疗效果要优于DL40组。3.2.ELISA检测小鼠肺泡灌洗中IFN-γ的含量发现,与模型组相比,合用组(DL20组、DL40组)均可使下降的IFN-γ的含量显著回升(P0.05),且DL40组的治疗效果要优于DL20组。3.3.将小鼠BALF中IL-4的含量与IFN-γ的含量作比,可得到Th2细胞与Th1细胞功能的失衡比,我们发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠Th2/Th1细胞功能严重失衡(P0.001),而两组合用组均可显著降低失衡比的指数(P0.001),其总体来说,DL20组的治疗效果优于DL40组。3.4.计算肺泡灌洗液中总细胞数和嗜酸性粒细胞比例结果显示,两个联合用药组均可显著下调过度分泌的炎症细胞且降低嗜酸性粒细胞在炎症细胞中的比例(P0.01),在控制炎症细胞过分泌方面,DL40组的效果略优于DL20组。3.5.ELISA检测小鼠血清中IgE含量发现,两个联合用药组均可显著下调由过敏性反应引起的小鼠血清中IgE含量升高(P0.01),使过敏性炎症得到显著缓解,且DL40组对血清中IgE含量下调效果优于DL20组。3.6.通过HE染色发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠的支气管壁上皮明显增厚、脱落,支气管平滑肌增厚,杯状细胞增生明显,气道周围可见大量嗜酸性粒细胞及巨噬细胞聚集浸润,病理评分指数显著升高(P0.001)。单独用药组对小鼠气道重塑均有抑制作用,病理评分指数显著下降(P0.001)。两个联合用药组小鼠抑制炎症细胞浸润的作用均强于三个单独用药组,均未见明显的气道上皮及平滑肌增厚,亦未见明显杯状细胞增生,病理评分指数显著下降(P0.001)。结论在大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的实验中,CAI可以显著缓解由LPS诱导的炎症因子分泌,且可以有效抑制NR8383中PDE-4B的表达。在小鼠过敏性气道炎的实验中,我们发现CAI可以有效缓解小鼠的气道高反应性,降低炎症因子分泌,缓解炎症细胞的聚集,降低血液中IgE的含量,缓解过敏现象。小鼠的气道重塑现象得到明显缓解,CAI会抑制平滑肌增厚,抑制杯状细胞增生,减少气道周围炎症细胞分泌聚集。且CAI可以有效抑制小鼠肺组织中PDE-4A、PDE-4B及PDE-4D的表达,是PDE4抑制剂。在联合用药的实验中我们发现,两个联合用药组均有良好的治疗效果,均比单独使用同等剂量的药物治疗效果明显,且使用低剂量地塞米松搭配低剂量的CAI表现出的治疗效果与单独使用高剂量地塞米松效果相当。在某些方面,DL20组的抗炎效果要优于DL40组。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R965

【参考文献】