醛固酮对成年豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流的影响

发布时间：2018-04-02 23:19

  本文选题：醛固酮　切入点：慢激活的延迟整流钾电流　出处：《河北医科大学》2015年博士论文

【摘要】：心肌肥厚、心衰时发生病理性电生理重构使得心脏的电生理不稳定性增加,常常伴发心律失常,心衰病人约一半以上因恶性心律失常的发生而猝死(即心性猝死Sudden cardiac death,SCD)。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在调节心血管功能中起着非常重要的作用,但是也可能导致各种心血管疾病的发生、发展,包括心肌肥厚和心力衰竭等。除了众所周知的RAAS血管紧张素II的作用,越来越多的证据已经表明,醛固酮除了通过作用于肾脏增加水和氯化钠的重吸收,参与水电解质平衡、血容量和血压的调节以外,还通过作用于心肌细胞的盐皮质激素受体在心血管疾病的病理发展过程中起着重要的作用。两个著名的临床实验(RALES和EPHESUS)显示,在利尿剂和血管紧张素转换酶抑制剂等经典治疗的基础上再加用醛固酮拮抗剂治疗可以显著降低心衰患者或急性心肌梗死患者SCD的发生率,提示醛固酮可能通过作用于盐皮质激素受体介导对心脏离子通道的调节,从而导致心律失常。心室肌细胞动作电位延长是心肌肥厚、心衰最典型的电生理重构特征。心室复极过程延迟容易产生早后除极,加上复极不同步造成心室跨壁离散度增大引发兴奋折返,为快速性室性心律失常创造了条件。很多研究已经发现减少去极化K+电流是动作电位延长的重要原因。延迟整流钾电流在复极过程中起着关键作用,它包括快延迟整流钾电流(IKr)和慢延迟整流钾电流(IKs)。人心脏IKr由HERG(human ether-a-go-go-related gene)基因编码。IKs由KCNQ1编码的α亚单位和KCNE1编码的β亚单位组成的异源多聚体。已经证明HERG、KCNQ1、KCNE1基因突变是离子通道病的基础。IKr和IKs下调是心肌肥厚、心衰动作电位延长的重要原因。我们前期的研究发现,RAAS中的重要成份血管紧张素II通过AT1受体下调IKr。尽管有研究表明醛固酮上调心室肌细胞L-型和T-型Ca2+通道,下调一过性外向型K+电流(Ito),醛固酮对于心室心肌细胞的延迟整流钾电流是否具有调节作用尚不清楚。成年的豚鼠心室细胞缺乏Ito,IKr和IKs是其动作电位复极的主要成份,我们前期实验已经发现高醛固酮血症可以延长豚鼠心室乳头肌动作电位,提示醛固酮可能具有调控IKr和IKs的作用。为此,本研究目的就是主要利用电生理技术在高醛固酮整体动物和体外培养细胞研究醛固酮对成年豚鼠心室肌细胞延迟整流K+电流IKr和IKs的影响,并分析其作用机制。第一部分高醛固酮血症对成年豚鼠心肌细胞延迟整流钾电流的影响目的:观察在体试验中高醛固酮血症对成年豚鼠心肌细胞动作电位、延迟整钾电流的影响。方法:成年雄性豚鼠,200-250g,每组10只,适应性饲养1周,2.5%三溴乙醇腹腔注射(225mg·kg 1)麻醉下背部皮下植入渗透性微泵给予醛固酮泵入28天。醛固酮溶解在聚乙二醇400(PEG-400,释放速度1μg·h 1)。对照组按相同方式植入微泵给予溶剂。各组豚鼠可以自由获得含0.5%Na+的正常食物和水,同时被保持在一个恒定饲养环境中(传统的12h/12h昼夜周期,6 am开始)。给药结束后,取豚鼠血液1.5-2 ml,测定血清K、Na离子浓度。之后取心脏,酶法急性分离豚鼠左室心肌细胞,利用全细胞膜片钳技术,分别记录动作电位、IKs、IKr,观察醛固酮对心肌动作电位和延迟整流钾电流IKs、IKr的影响。采用电压钳进行刺激和记录。膜片钳技术V-clamp模式记录细胞膜电流,微电极抛光后,灌充电极内液,控制电阻值在1-3M?。电极内液成分为(m M):KCl 140,Mg-ATP 4,Mg Cl2 1,EGTA 5,and HEPES10(p H 7.2 with KOH);电极外液分为(m M):Na Cl 132,KCl 4,Ca Cl2 1.8,Mg Cl2 1.2,glucose 5 and HEPES 10(p H 7.4 with Na OH)。钳制电压在-40m V,使Na通道和T-型Ca通道失活;电极外液中加入尼莫地平(Nim,1μM),阻断L-型Ca通道;记录IKs时加入2mM E4031,阻断延迟整流钾电流快激活成分IKr;记录IKr时加入20mM chromanol 293B,阻断延迟整流钾电流慢激活成分IKs。采用膜片钳技术I-clamp模式:两性霉素B(终浓度600ng/ml)加入电极内液中,做穿孔膜片钳记录。在0.25Hz、0.5Hz、1Hz不同频率下记录豚鼠心室肌细胞膜动作电位。电极内液成分为(m M):谷氨酸钾120,KCl 25,Mg Cl2 1,Ca Cl2 1,HEPES 10(p H 7.4 with KOH);电极外液分为(m M):Na Cl 138,KCl 4,Mg Cl2 1,Ca Cl2 2,Na H2PO4 0.33,glucose 10 and HEPES 10(p H 7.4 with Na OH)。通道激活的电流-电压关系曲线用Boltzmann方程I/Imax=1/(1+exp[(Vt-V1/2)/k]拟合,其中V1/2为半数激活电压。用Origin Pro 7.0,Adobe Illustrator 10,SPSS 19进行图象处理及数据分析。实验数据以mean±SEM表示,两组比较采用非配对Student’s t检验,多组间比较采用ANOVA及Dunnett’s post hoc检验。P0.05时认为差异具有统计学意义。结果： 1对照组、醛固酮组、螺内酯组、螺内酯合用醛固酮组血清钾浓度、血清钠浓度均没有统计学差异(P0.05)。同样,我们前期的实验研究中发现这种方式制备高醛固酮血症豚鼠模型不影响豚鼠血压。2醛固酮长期刺激延长成年豚鼠心室肌细胞动作电位。在不同刺激频率下(0.25 Hz、0.5 Hz、1 Hz),醛固酮泵入组豚鼠左室心肌细胞APD90显著延长。3醛固酮长期刺激下调豚鼠心肌细胞IKs,但是醛固酮没有改变通道的电压依赖活性,对照组与醛固酮组半数激活电压分别是:37.4±2.8 m V、39.3±2.0 m V,没有统计学差异(P0.05)。4醛固酮并不影响IKr电流密度,也没有改变其电生理学特性。表明醛固酮对钾通道的调节作用具有选择性。结论:醛固酮长期刺激下调成年豚鼠心室肌细胞IKs,延迟心肌细胞复极化,而且不依赖于血压升高和电解质的紊乱。醛固酮并不影响IKr,表明醛固酮对钾通道的调节作用具有选择性。第二部分醛固酮对体外培养成年豚鼠心肌细胞延迟整流钾电流的影响目的:为了验证整体高醛固酮血症模型下延迟整流钾电流的变化,进一步观察醛固酮对体外培养心肌细胞延迟整流钾电流的影响。方法:严格无菌操作急性分离成年豚鼠心肌细胞后,心肌细胞逐级覆钙(200,500,1000,and 1800μM)。静置2h后去除死细胞。将醛固酮或DMSO溶剂分别加入新鲜培养基(Hyclone M199+Earle’s salts和L-glutamine)。细胞放入培养基后在37°C,5%CO2细胞孵育箱继续孵育24小时。M199培养基中含有10%胎牛血清、2m M L-肉毒奸、5m M肌氨酸、100IU·ml-1青霉素、链霉素100μg·ml-1。利用全细胞膜片钳技术,记录培养豚鼠心肌细胞IKs、IKr,观察醛固酮在体外对培养心肌细胞延迟整流钾电流的影响。结果： 1醛固酮孵育心肌细胞24小时,下调心肌细胞IKs电流密度,此作用呈浓度依赖性。但醛固酮并不改变IKs通道的电压依赖性的激活特性。2醛固酮(1μmol·L-1)孵育心肌细胞24小时,不改变心肌细胞IKr电流密度,也不改变其电生理学特性。结论:与整体实验结果一致,在培养的成年豚鼠心肌细胞,醛固酮具有选择性下调IKs电流密度的作用。第三部分醛固酮下调心肌细胞延迟整流钾电流慢激活成分的机制目的:利用整体动物模型或体外培养细胞,探究醛固酮下调IKs的分子机制。方法:整体动物给予醛固酮的方法同第一部分。为了评价醛固酮受体(MR)的中介作用,部分给予醛固酮的动物同时给予MR拮抗剂螺内酯(100 mg·kg 1·day 1)灌胃。给药28天后,比较联合应用螺内酯与单用醛固酮组心室肌细胞IKs之间的差别。体外培养成年豚鼠心室肌细胞的方法同第一部分。为进一步明确盐皮质激素受体途径、血管紧张素ⅡAT1途径以及细胞内钙介导醛固酮对IKs的影响,用以下工具药物与醛固酮共同孵育分离的心肌细胞24小时:MR拮抗剂螺内酯10μmol·L-1、热休克蛋白HSP90抑制剂格尔德霉素1μmol·L-1、血管紧张素Ⅱ转化酶抑制剂依那普利1μmol·L-1、AT1拮抗剂氯沙坦1μmol·L-1、L-型钙通道阻断剂尼莫地平1μmol·L-1、可膜通透性钙离子螯合剂BAPTA-AM2.5μmol·L-1。利用全细胞膜片钳技术,记录培养豚鼠心肌细胞IKs,观察这些工具要是否参与醛固酮对IKs的调节。成年豚鼠泵入醛固酮28天后或正常分离后的成年豚鼠心肌细胞经醛固酮孵育24h,Trizol法提取心肌细胞总RNA,明确醛固酮对成年豚鼠心肌细胞钾通道KCNQ1、KCNE1以及ERG m RNA水平的影响。同时提取膜蛋白或全蛋白,做Westernblot分析,明确醛固酮对成年豚鼠心肌细胞上述钾通道蛋白合成水平的影响。结果： 1不管是在体实验,还是离体实验,盐皮质激素受体(MR)拮抗剂螺内酯可以完全防止醛固酮引起的心肌细胞下调IKs的作用。HSP90抑制剂格尔德霉素、血管紧张素Ⅱ转化酶抑制剂依那普利、AT1拮抗剂氯沙坦等分别与醛固酮共同孵育分离的心肌细胞24h后,可以逆转醛固酮下调心肌细胞IKs。2钙通道拮抗剂尼莫地平、钙螯合剂BAPTA-AM等分别与醛固酮共同孵育分离的心肌细胞24h后,不能逆转醛固酮下调心肌细胞IKs,而且尼莫地平、BAPTA-AM本身下调心肌细胞IKs。3成年豚鼠泵入醛固酮28天后,醛固酮抑制心肌细胞KCNQ1、KCNE1 m RNA转录及KCNQ1、KCNE1蛋白合成;而醛固酮不影响ERG m RNA转录及蛋白合成。4正常分离后的成年豚鼠心肌细胞与醛固酮孵育24h,醛固酮抑制心肌细胞KCNQ1、KCNE1蛋白合成及KCNQ1、KCNE1m RNA转录,而醛固酮不影响ERG m RNA转录及蛋白合成。结论:醛固酮通过经典受体途径,抑制心肌细胞KCNQ1、KCNE1m RNA转录及蛋白合成,下调心肌细胞IKs。醛固酮作用于心肌MR下调IKs过程中,MR受体与血管紧张素Ⅱ产生以及AT1之间可能存在相互作用。但是醛固酮下调IKs并不是继发于醛固酮对细胞内钙信号调节及内向型L-型钙电流的增加。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
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本文编号：1702564