Exosomes作为药物载体的功能化研究

发布时间：2018-04-05 16:07

本文选题：exosomes　切入点：基因载体　出处：《东南大学》2017年博士论文

【摘要】：随着分子生物学以及基因组学研究的深入,越来越多疾病的发生被发现与基因异常密切相关,或者其发生过程伴有基因表达异常现象,因此探讨如何从基因层面治疗疾病已经成为研究热点。尤其是最近十多年来包括微小RNA(microRNAs)、siRNA(Small interfering RNA)以及长链非编码 RNA(long noncodingRNA,lncRNA)的发现,更是加速了基因治疗的发展。由于基因治疗所要递送的DNA、RNA或类寡核苷酸分子在体内极不稳定,很容易在未到达病变细胞之前被核酸酶破坏或降解,很难到达靶组织和细胞发挥作用,因此高效、安全的基因递送载体成为了基因治疗的关键因素。目前常用的基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类,病毒类载体的优势是具有较好的基因转染能力,缺点是其毒性、免疫源性、致癌作用和难以大规模生产等问题难以克服;而非病毒载体同样存在免疫原性的问题。因此构建具有体内外转染效率高、特异靶向性强和生物安全性好的基因载体显得十分迫切。外泌体(exosomes)是一种由细胞向外分泌的膜性囊泡,其中含有包括核酸、蛋白因子在内的多种生物活性物质,目前已经证实exosomes能够将这些来源于亲代细胞中的生物学活性物质转导至受体细胞,影响受体细胞的生物学行为,扮演着细胞间信号传导载体的角色。这其中最引人注目的就是exosomes中含有丰富的miRNA,这些miRNA借助exosomes从供体细胞进入受体细胞,通过调控受体细胞中靶基因的表达,影响受体细胞的生物学行为。在生物体内exosomes是一种天然的核酸和细胞因子的载体,受此启发,近年来,陆续有研究者开展exosomes作为外源药物载体的研究。本论文围绕这一领域,针对exosomes共载化疗药物和基因药物用于肿瘤的协同治疗、exosomes如何高效的载入外源基因药物等方面展开研究,取得如下创新性研究成果:1、开展了 exosomes同时作为基因药物和化疗药物共载体治疗肿瘤的研究。我们首先通过基因重组技术构建了能够展示于exosomes表面、同时具有靶向Her2作用的融合蛋白(tar-Her2)表达质粒,之后通过HEK293T细胞过表达该融合蛋白,成功获得表面含有靶向Her2的重组蛋白的exosomes;随后,通过电穿孔法成功将miR-21 inhibitor和5-Fu导入exosomes中,实现了 exosomes共载化疗药物和基因药物。之后,我们开展了 Tar-Her2-EXO/miR-21inhibitor/5-FU的体外和体内的抗肿瘤活性和靶向性研究。结果显示,Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor/5-FU在体外及体内对Her2高表达的HCT116细胞及其皮下移植瘤均具有较好的靶向作用。同时,我们还发现Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor/5-FU在体外和体内对肿瘤的抑制作用具有抑制作用,并且显著强于Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor或Tar-Her2-EXO/5-FU,表明exosomes作为基因药物和化疗药物共载体,有利于发挥两种药物的协同作用,提高肿瘤治疗的疗效。2、建立了通过生物学方法获得含有功能性小RNA的exosomes的方法。我们首先构建了 miR-21、siR-artificiality以及miR-21 decoy慢病毒表达载体,之后基于HEK293T细胞建立了上述三种功能性小RNA的稳定表达细胞株,收集并分析了三种细胞来源的exosomes中相应过表达的功能RNA的水平,结果显示细胞中过表达的功能性小RNA均能够进入exosomes中。之后,我们又通过双荧光素酶报告基因技术、EGFP报告基因技术等考察了含有功能小RNA的exosomes对受体细胞中靶基因的影响,结果显示这些带有功能性小RNA的exosomes进入受体细胞后,能够对受体细胞中靶基因的表达,或相应miRNA的功能产生影响。3、探讨了通过生物工程方法获得含有siR-PLK1的exosomes(EXO-siR-PLK1),并在体外探讨EXO-siR-PLK1的抗肿瘤作用。我们首先构建了能够表达siR-PLK1和PLK1 silence mutation慢病毒载体,在此基础上建立了过表达siR-PLK1的细胞株,并获取了其来源的exosomes(EXO-siR-PLK1)。使用EXO-siR-PLK1处理BT474细胞后,BT474细胞中PLK1的表达被显著抑制。我们还考察了 EXO-siR-PLK1对BT474细胞周期及增殖的影响,结果显示EXO-siR-PLK1能够破坏BT474细胞的有丝分裂过程,细胞周期被阻滞于G2/M期,同时EXO-siR-PLK1对BT474增殖的抑制作用具有浓度依赖性。综上所述,本论文的研究丰富了 exosomes作为基因药物及小分子药物载体的方法。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

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