ATP敏感性钾通道开放剂对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的实验治疗学效应

发布时间：2018-04-16 04:36

本文选题：脑卒中 + ATP敏感性钾通道　；参考：《南京医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：脑卒中,是一种突然发生的脑血液循环障碍性疾病,具有发病率高,致死致残率高等特点,严重危害着人类的健康。脑卒中可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中70%左右为缺血性脑卒中。迄今为止,已经阐明的脑缺血再灌注的损伤机制包括：能量耗竭、钙超载、兴奋性毒性、氧化应激、炎症及凋亡等。近几十年,虽然对于脑缺血再灌注损伤的病理机制研究取得了较大的进展,但由基础研究向临床应用转化的进展极其缓慢,目前脑缺血仍缺乏理想的治疗药物,唯一得到公认的治疗药物是重组组织纤溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen activator, r-tPA)。但是,r-tPA严格的治疗时间窗和严重的副作用等大大限制了其在临床中的使用。因此,研究脑卒中导致的神经损伤的病理机制、寻找有效的治疗靶点、研制理想的治疗药物十分紧迫。近年来的研究提示,脑神经功能的恢复不能仅着眼于单一的神经元保护,而应关注包括神经元、星形胶质细胞以及内皮细胞在内的整个神经血管单元的保护及脑缺血后神经再生。 ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel, K-ATP通道)是机体内耦联细胞能量代谢和电活动的独特生物感受器,以细胞内ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。K-ATP通道在脑内广泛分布,其在脑内不同细胞上分子构成多样性的特点为其成为神经血管单元的保护靶标提供了结构基础。正常生理状态下,脑内K-ATP通道处于关闭状态,当脑组织处于缺血缺氧等应激状态时,K-ATP通道开放使K+外流、细胞超极化,抑制兴奋性神经毒性、发挥对神经元的保护作用。此外,离体研究表明,开放K-ATP通道还能够调节星形胶质细胞的功能,抑制小胶质细胞的活化,促进干细胞增殖。因此,K-ATP通道开放是机体重要的内源性保护机制。埃他卡林是一种具有脂肪胺结构的新型小分子化合物,是磺酰脲受体2(sulphonylurea receptor2, SUR2)型K-ATP通道的选择性激动剂,并能够透过血脑屏障。体内研究与体外研究均表明,埃他卡林对缺血性脑损伤具有神经保护作用。在沙土鼠全脑缺血模型上,埃他卡林对缺血引起的运动功能障碍具有明显拮抗作用,其能够减少脑内兴奋性递质的释放,从而减少神经元丢失。在脑卒中易感型大鼠盐负荷模型中,埃他卡林能够降低脑卒中发生率及死亡率,延缓脑卒中的发生,延长模型动物的存活。此外,在大鼠大脑中动脉梗阻(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型上,埃他卡林可以减小脑梗死体积,改善神经功能障碍,减轻脑水肿。这些研究揭示,埃他卡林可通过抑制兴奋性毒性等在脑卒中损伤中发挥确切的神经保护作用。最新研究表明,炎症小体的激活在脑缺血再灌注损伤中发挥着重要作用,应用NLRP3-/-小鼠制备局部脑缺血模型,结果显示敲除NLRP3(NOD-like receptor pyrin domain containing three, NOD样受体pyrin结合区域3)能够减小脑梗死体积,减轻血脑屏障的破坏。埃他卡林能否通过抑制NLRP3炎症小体激活而在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用?目前尚未见到相关报道。另外,本实验室前期研究结果表明,K-ATP通道可调节星形胶质细胞内营养因子的表达；K-ATP通道开放剂具有促神经干细胞增殖作用,因而具有促修复作用。而K-ATP通道开放剂对脑缺血再灌注损伤的后期修复是否具有促进作用尚不明确。鉴于上述,本文应用雄性SD大鼠制备MCAO模型,研究埃他卡林对于局灶性脑缺血再灌注损伤急性期的作用,揭示其神经保护作用的新机制；并且,研究、阐明埃他卡林在大鼠脑缺血再灌注损伤后期修复中的作用。目的：研究K-ATP通道开放剂埃他卡林对大鼠局灶性脑缺血再灌注急性期神经损伤及后期修复的影响。方法：应用雄性SD大鼠,采用线栓法建立MCAO模型,缺血开始后立即给予不同剂量的K-ATP通道开放剂埃他卡林(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg),缺血90min后恢复再灌。脑缺血再灌后24h,比较模型组与不同剂量埃他卡林治疗组之间的神经功能缺陷;应用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC)染色法比较脑梗死体积的变化。脑缺血再灌注后72h,应用免疫组织化学染色法观察缺血脑组织区域神经元及梗死区周围的星形胶质细胞的形态与数量的改变；应用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测脑内固有免疫细胞——小胶质细胞标志物CD11b(ClusterofDiffercntiation.11b,分化抗原簇-11b)、凋亡相关蛋白caspase-3剪接体(cleaved caspase-3),以及炎症相关蛋白核转录因子κB (nuclear factor-κ B, NF-κB), caspase-1,白介素-1beta (interleukin-1β, IL-1β)的变化；应用实时荧光定量PCR (real-time PCR)方法检测NLRP3在转录水平的变化。建立大鼠MCAO模型后,每日一次给予2mg/kg埃他卡林,持续给药35天。分别在第7、14、21、28、35天进行以下实验：应用转角测试和圆桶测试评价大鼠的运动功能；应用免疫组织化学染色方法观察脑室管膜下区(Subventricular zone,SVZ)的神经元、星形胶质细胞活化及增殖的变化；应用western blot方法检测缺血半影区小胶质细胞的水平。结果： 1.埃他卡林能够减轻大鼠局灶脑缺血再灌注所致的急性损伤埃他卡林(2mg/kg与4mg/kg)能够改善大鼠脑缺血再灌注急性期的神经运动功能障碍、减小脑梗死体积,且具有剂量依赖性；埃他卡林(2mg/kg)能够显著减少大鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死区神经元的丢失,抑制梗死区边缘星形胶质细胞及半影区小胶质细胞的活化与增殖。 2.埃他卡林能够抑制大鼠脑缺血再灌注损伤所诱发的细胞凋亡与炎症反应埃他卡林(2mg/kg)可以降低凋亡相关蛋白caspase-3的活化；同时,埃他卡林可显著抑制与炎症有关的核转录因子NF-κB的核转位,并抑制炎症小体的激活。 3.埃他卡林对大鼠脑缺血再灌注损伤后期感觉运动功能障碍的恢复及SVZ区的细胞增殖无显著影响。 4.埃他卡林促进神经元存活埃他卡林(2mg/kg/d×35d)能够增加脑缺血再灌注损伤后期SVZ区成熟神经元的数量。 5.埃他卡林能够抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后期胶质细胞的活化与增殖埃他卡林(2mg/kg/d×35d)能够持续抑制大鼠脑缺血再灌注损伤引起的SVZ区星形胶质细胞的活化与增殖,并且显著抑制缺血半影区小胶质细胞标志蛋白CDllb的表达。结论： 1.埃他卡林能够减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注所致的急性损伤,其作用机制与抑制胶质细胞的增殖与活化及炎症小体的激活有关。 2.埃他卡林能够促进脑缺血再灌注损伤后期SVZ区神经元的存活,并且持续抑制星形胶质细胞及半影区炎症细胞的增殖与活化；但是,对大鼠感觉运动障碍的恢复速度及SVZ区的细胞增殖无显著影响。综上所述,本研究工作的主要创新点在于： 1.阐明埃他卡林通过抑制脑缺血再灌注损伤后胶质细胞活化和NLRP3炎症小体的激活而发挥经保护作用的新机制。 2.揭示长期开放K-ATP通道可以持续抑制脑缺血再灌注损伤后期胶质细胞的活化与增殖、并促进神经元的存活。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965

【参考文献】