肝癌病人肝纤维化组织中CYP450酶代谢活性的改变

发布时间：2018-05-15 11:36

本文选题：肝纤维化 + 人肝微粒体　；参考：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：肝纤维化(Liver fibrosis,LF)是慢性肝病发展过程中常见的一种病理状态,其发生与外在因素(长期接触致癌剂黄曲霉素、肝炎病毒的持续感染、长期酒精摄取)以及内在代谢疾病(糖尿病、肥胖)等相关。疾病早期,机体表现出对内外刺激的一种炎性损伤修复反应,也就是肝硬化的早期,此过程是可逆的。当刺激长期持续性进行,肝纤维化程度不断进展形成肝硬化(Hepacullar cirosis)、最后恶化成肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。肝脏是人体内最大的代谢器官,疾病状态下其代谢功能发生改变。研究肝脏疾病状态下CYP酶代谢活性改变的目的是为临床调整给药剂量,给出合理的个性化用药意见,从而缓解疾病的发生发展。前期我们在人肝体外代谢发现,肝细胞肝癌患者的CYP酶活性与正常人相比发生改变,CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP3A4/5的活性降低,而CYP2E1的活性升高。但是,不同疾病状态下,CYP酶活性的改变是不同的。目前的研究侧重于直接在肝癌癌组织或者肝硬化组织上进行,忽略了从肝纤维化到肝硬化最终到肝癌这一种重要过程。因此,在肝纤维化状态下研究肝脏CYP酶活性的改变对肝癌发生发展的研究具有重要意义。此外,我们通常以每毫克微粒体蛋白的酶活性来表示CYP酶探针药物体外代谢的活性,但是所测得的酶活性结果与一些文献报道的多数CYP酶在肝病晚期酶活性降低不甚相符,此原因可能是由于我们忽略了我们所取肝脏组织本身的差别,体外研究的目的是为了推测体内的真实情况,因此,有必要在肝脏水平建立一种酶活性的表示方法,作为对实际状态下肝脏的真实反映。由于肝脏的实际大小重量我们难以获得,只能以一些报道中的人体体重等相关生理数据来推测,即通过测定的每克肝脏中微粒体含量(Microsomal protein per gram of liver,MPPGL),推算得出相应肝脏水平酶活性。本课题以78例正常人肝脏组织和53例肝癌病人的肝纤维化组织为研究对象,共测定组织中10种主要的CYP酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8C、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1以及CYP3A4/5)对其探针药物的在微粒体水平的代谢活性;测定了肝脏中微粒体蛋白浓度以及每克肝脏中微粒体蛋白的含量(MPPGL);并推算出在肝脏水平10种CYP酶的代谢活性;分析了肝纤维化不同程度以及人口学因素对CYP酶活性的影响。通过本课题研究,以期发现肝癌发展进程中的纤维化阶段CYP酶代谢活性的个体差异及其影响因素,为日后指导临床调整给药剂量、合理用药提供理论基础。方法1肝脏标本的收集本研究所收集的正常人肝脏标本为常规手术切除的非肿瘤肝脏组织,主要为肝血管瘤、胆结石和胆囊病变的病人,其肝功能均正常,没有HBV或者HCV的感染,经过组织病理学证实为正常的肝脏标本。所收集的肝纤维化标本取自正规手术切除的肿瘤外的癌旁组织,伴有HBV或者HCV感染,该组织均经过组织病理学证实具有纤维化病变。该组组织标本经过处理根据Scheuer分级标准,按照纤维化程度分为四期即S0-S3期。所有标本手术切除后,经一些列标准方法处理,于60分钟以内处理后于液氮中保存备用。2肝微粒体的制备及MPPGL的测定采用差速离心法制备人肝微粒体,并且用Bradford法测定肝微粒体蛋白浓度。每克肝脏微粒体蛋白含量(MPPGL)采用肝微粒体蛋白浓度×体积/肝标本净重/肝脏回收率计算得到。3微粒体水平10种CYP酶对探针底物代谢活性的测定10种CYP酶探针底物分别为:CYP1A2探针底物为非那西丁,CYP2A6探针底物为香豆素,CYP2B6探针底物为安非他酮,CYP2C8探针底物为紫杉醇,CYP2C9探针底物为甲苯磺丁脲,CYP2C19探针底物为奥美拉唑,CYP2D6探针底物为右美沙芬,CYP2E1探针底物为氯唑沙宗,CYP3A4/5探针底物为咪达唑仑;所有代谢产物均采用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)联合紫外(UV)或者荧光(FLD)检测法;反应速度用底物的生物转化程度(TR)表示;Graph Pad Prism 5.0软件计算K_m和V_(max),清除率CLM为V_(max)与K_m的比值。所建立的方法经验证均有良好的线性关系,并且符合生物样本测定的要求。4肝脏水平10种CYP酶对探针底物代谢活性的推算肝脏水平的清除率(CLL)采用微粒体水平的清除率(CLM)×MPPGL计算得出;肝脏水平的最大反应速率(V_(max) L)采用微粒体水平的最大反应速率(V_(max) M)×MPPGL计算得出。5统计学分析采用SPSS17.0统计软件对各项数据进行统计学分析,Graph Pad Prism 5.0软件计算酶动力学参数,酶活性数据进行正态性检验,对非正态性的数据,采用非参数检验分析,检验水准α为0.05。结果1肝脏标本正常组织中男性27例,女性51例,年龄45岁的共51例,≤45岁的共27例,吸烟者15例,不吸烟者63例,饮酒者14例,不饮酒者64例。肝纤维化组中男性45例,女性8例,年龄45岁的共42例,≤45岁的共11例,吸烟者27例,不吸烟者26例,饮酒者17例,不饮酒者36例。用药史为均未使用CYP酶的抑制或者诱导剂。肝纤维化组织的分级中其中S0=3例,S1=5例,S2=19例,S3=26例。2每克肝脏的微粒体蛋白含量(MPPGL)正常人肝组共78例,其MPPGL的中位数为34.0 mg·g-1,范围为9.9~128mg·g-1,95%置信区间为14.2~116.8 mg·g-1。肝纤维化组共53例,其MPPGL的中位数为28.6 mg·g-1,范围为7.6~93.6 mg·g-1,95%的置信区间为9.4~82.2 mg·g-1。在正常人肝中MPPGL相差约13倍,在肝纤维化组中MPPGL相差约12.3倍。肝纤维化组中的MPPGL显著性低于正常肝脏组织(P0.01)。3 10种CYP酶的代谢活性3.1肝微粒体水平酶的代谢活性肝微粒体水平的酶活性用CYP酶对探针药物的清除率来代表,以每毫克肝微粒体蛋白为单位。在正常肝脏组中,CYP酶活性表现出巨大差异。CLM在CYP2C19和2A6表现出最大差异,差异倍数分比为166倍和454倍,其余依次为CYP3A4/5CYP2C8CYP2B6CYP2D6CYP1A2CYP2E1CYP2C9,依次倍数为73、46、40、33、21、12、5。在肝纤维化组中,CYP酶活性也表现出巨大差异。CLM在CYP2A6和1A2表现出最大差异,差异倍数分比为284倍和143倍,其余依次为CYP2D6CYP2C8CYP2B6CYP2C9CYP2C19CYP3A4/5CYP2E1,依次倍数为109、100、56、48、20、6、4。在微粒体水平,与正常对照组相比,肝纤维化组CLM降低的有CYP1A2、CYP2C8;不变的有CYP2A6、CYP2B6、CYP2C19;升高的有CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5、CYP2E1。与正常对照组相比,肝纤维化组V_(max)降低的有CYP1A2、CYP2C8;不变的有CYP2C19;升高的有CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4/5、CYP2D6。3.2肝组织水平酶的代谢活性肝组织水平的酶活性用CYP酶对探针药物的清除率来代表,是根据肝组织的MPPGL含量,由微粒体水平酶活性计算得出,其以每克肝脏为单位。在正常肝脏组织中,CYP酶活性表现出巨大差异。CLL在CYP2B6和CYP2C19表现出最大差异,差异倍数分比为740倍和110倍,其余依次为CYP3A4/5CYP2C8CYP1A2CYP2A6=CYP2C8CYP2C9=CYP2E1,依次倍数为90、66、51、29、29、24、24。在肝纤维化组,CYP酶活性也表现出巨大差异。CLL在CYP2A6和1A2表现出最大差异,差异倍数分别为2546倍和266倍,其余依次为CYP2D6CYP2C8CYP2B6CYP2C9CYP2C19CYP2E1CYP3A4/5,依次倍数为241.5、137、74、49、29、20、14。与正常对照组相比,肝纤维化组组在肝脏水平CLL降低的有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19;不变的CYP2A6、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5;升高的有CYP2E1。与正常对照组相比,肝纤维化组V_(max)降低的有CYP1A2、CYP2C8;不变的有CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5;升高的有CYP2E1。4微粒体水平和肝脏水平酶动力学参数的相关性4.1 10种CYP酶两种水平的V_(max)的相关性4.1.1正常肝脏组10种酶两种水平的V_(max)的相关性采用Spearman检验对正常肝脏中10种CYP酶在两种水平的V_(max)进行相关性分析,CYP3A4/5的相关性最高为R=0.684,CYP2C9的相关性最低为R=0.330。CYP1A2的相关性为R=0.667,CYP2A6相关性为R=0.652,CYP2B6相关性为R=0.532,CYP2C8相关性为R=0.530,CYP2C9相关性为R=0.330,CYP2C19相关性为R=0.588,CYP2D6相关性为R=0.562,CYP2E1相关性为R=0.608,CYP3A4/5相关性为R=0.684。10种酶的V_(max)两种水平的相关性为P0.01。4.1.2肝纤维化组10种酶两种水平的V_(max)的相关性采用Spearman检验对纤维化组10种CYP酶在两种水平的V_(max)进行相关性分析,相关性最高的为CYP3A4/5其相关性R=0.781,相关性最低的为CYP1A2其相关性为R=0.528。其余的几种酶的相关性分别为CYP2A6相关性R=0.681,CYP2B6相关性R=0.711,CYP2C8相关性R=0.589,CYP2C9相关性R=0.565,CYP2C19相关性R=0.585,CYP2D6相关性R=0.671,CYP2E1相关性R=0.581。10种酶两种水平的V_(max)均具有一定的相关性,P0.01。4.2 10种CYP酶在两种水平的CL的相关性4.2.1正常肝脏组10种酶两种水平的CL的相关性采用Spearman检验对正常组10种CYP酶在两种水平的CL进行相关性分析,CYP1A2的相关性为R=0.554,CYP2A6相关性为R=0.565,CYP2B6相关性为R=0.642,CYP2C8相关性为R=0.579,CYP2C9相关性为R=0.564,CYP2C19相关性为R=0.574,CYP2D6相关性为R=0.708,CYP2E1相关性为R=0.482,CYP3A4/5相关性为R=0.553。10种酶两种水平的清除率的相关性为P0.01。4.2.2肝纤维化组10种酶两种水平的CL的相关性采用Spearman检验对纤维化组10种CYP酶在两种水平的CL进行相关性分析,CYP1A2的相关性为R=0.122,CYP2A6相关性为R=0.138,CYP2B6相关性为R=0.073,CYP2C8相关性为R=0.103,CYP2C9相关性为R=0.138,CYP2C19相关性为R=0.046,CYP2D6相关性为R=0.087,CYP2E1相关性为R=0.073,CYP3A4/5相关性为R=0.121。10种CYP酶清除率在两种水平上均无相关性。5肝脏纤维化程度对酶活性的影响在微粒体水平,CYP1A2的K_m和V_(max)在S1,S2和S3组都高于正常组,且P0.01;而CLM三组都低于正常组,S1组P0.05,S2和S3与正常组相比P0.01。CYP2A6的V_(max)在S2和S3组均明显高于正常组,P0.05;K_m在S2和S3组同样明显高于正常组,P0.05;CLM在正常组和肝纤维化组没有显著差异。CYP2B6的V_(max)在S1和S3组明显高于正常组,P0.01;K_m在S3组明显高于正常组,P0.01;CLM在正常组和肝纤维化组没有影响。CYP2C8在的V_(max)在肝纤维化组明显的低于正常组,K_m明显的高于正常组,CLM明显的低于正常组,且P0.01。CYP2C9的V_(max)、K_m和CLM在正常组和纤维化组没有明显的差异。CYP2C19的V_(max)和CLM在S3组明显的低于正常组,P0.01;而K_m在两组之间没有变化。CYP2D6的S3组的CLM明显高于正常组,P0.05;V_(max)和K_m在正常组和纤维化组之间没有差异。CYP2E1的V_(max)、K_m和CLM在S1、S2和S3组都明显的高于正常组,P0.01。CYP3A4/5的V_(max)、K_m在S1、S2和S3组都明显的高于正常组,P0.01;CLM没有差异。6人口学因素对酶活性的影响在正常组织中,微粒体水平CYP1A2的V_(max)和CLM在男性中明显高于女性P0.05;CYP1A2吸烟者V_(max)明显高于不吸烟者,P0.05;CYP2C9的V_(max)吸烟者明显的高于不吸烟者,P0.05;CYP2D6吸烟者清除率明显高于不吸烟者,P0.01;CYP2C9饮酒者V_(max)和CLM都明显的高于不饮酒者P0.01;微粒体水平年龄对微粒体水平的酶动力学参数没有显著影响。肝脏水平CYP1A2的V_(max)在男性中明显的高于女性,P0.05。在肝纤维化组,微粒体水平CYP2A6的K_m饮酒者明显低于不饮酒者,P0.05;CYP2B6的CLM男性明显高于女性,P0.05;年龄和吸烟在微粒体水平对酶动力学没有影响。在肝脏水平CYP2B6的CLM男性中明显的高于女性,P0.05。结论1.人肝MPPGL含量存在较大个体差异,正常人肝脏MPPGL差异约13倍,纤维化组织MPPGL差异约12.3倍,纤维化组织与正常组相比,MPPGL显著降低(P0.01);2.肝癌病人的肝纤维化组织CYP酶代谢活性发生改变,且存在较大的个体差异;与正常组织相比,不同酶活性改变不同;3.微粒体和肝脏两种水平表示的CYP酶活性有所不同,肝脏水平CYP酶活性变化更显著,其更优于微粒体水平;4.肝纤维化程度对不同代谢酶的影响不同;5.人口学因素对酶活性的影响不大。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R969

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