载siRNA纳米复合物的构建和体外评价

发布时间：2018-06-13 15:20

本文选题：小干扰RNA + 细胞穿膜肽　；参考：《河北医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:近年来,RNA干扰在基因功能和基因治疗方面的研究较为广泛,已逐渐发展为一种较成熟的技术。RNA干扰是一种特异性细胞后转录机制,通过诱发相应mRNA的酶降解发挥基因沉默作用。双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是RNA干扰的效应分子之一,理论上可抑制任何靶基因表达,已被列为基因型疾病的潜在治疗剂。但是,裸露的siRNA进入血清易被核酸酶降解,且siRNA带负电荷,亲水性强,导致其不易透过细胞膜进入细胞质发挥高效的RNAi作用。因此,siRNA应用的关键在于寻找安全、有效的递送载体。目前已有很多载体用于改善siRNA的核酸酶抗性而又不干扰其沉默效率。其中,细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)作为基因递送载体被广泛研究且表现出很大的优势。细胞穿膜肽通常由5~30个氨基酸构成,是一类能携带大分子物质进入细胞的阳离子或两亲性短肽。它可将不同的货物分子转运到细胞和组织中而不引起显著毒副作用。本文拟构建一种可以包载核酸类药物siRNA并提高其转染效果的纳米复合物。首先选取细胞穿膜肽中的八聚精氨酸(R8)作为siRNA的基本载体,采用硬脂酸和聚乙二醇对其进行修饰,合成出几种载体材料。再将载体材料与siRNA孵育制备成纳米复合物。然后,通过纳米粒度和zeta电位分析仪及琼脂糖凝胶电泳试验考察纳米复合物的理化性质和包载能力,从而筛选出能够缩合并递送siRNA入胞的复合物。最后,以MCF-7、A549为模型细胞进行细胞摄取试验,通过与市售产品(Lipofectamine2000)作比较,考察自制复合物介导siRNA入胞的效果。方法:1载体合成:首先,合成SA-R8。先制备SA活化反应液,再取SA活化液加入到R8溶液中反应30min,然后将反应液以纯净水为透析液透析24 h,透析结束后取少量透析液进行质谱分析。接着,用合成的SA-R8与mPEG2000-Mal和mPEG5000-Mal反应合成SA-R8-PEG,同样将反应液以纯净水为透析液透析纯化,然后取适量透析液质谱检测。2复合物制备及评价:合成的载体材料具备两亲性,在极性溶剂中能自组装成纳米粒;八聚精氨酸(r8)带正电荷,可通过静电相互作用缩合带负电荷的sirna。基于以上原理,首先,用depc水溶解载体材料使自组装成空白纳米粒,随后加入药物sirna涡旋静置,制备载sirna的纳米复合物。然后,通过纳米粒度和zeta电位分析仪对复合物的粒径、电位进行测定。接着,通过琼脂糖凝胶电泳试验对复合物包载sirna的能力进行考察。根据考察结果,筛选出粒径、电位合适且能够完全包载sirna的复合物。最后,以mcf-7和a549两种细胞为模型细胞,将筛选出的最佳复合物与游离sirna和市售产品(lipofectamine2000)一同给药进行细胞摄取试验,通过流式细胞分析仪定量检测及评价自制复合物的细胞转染效果。结果:质谱检测结果显示,合成的sa-r8、sa-r8-peg2000和sa-r8-peg5000实际分子量与理论值一致或相近;复合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna的平均粒径在300~400nm之间,复合物(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/sirna平均粒径在500~800nm之间,随着n/p比的增大,两者zeta电位从负变为正;琼脂糖凝胶电泳试验显示,两种复合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna和(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/sirna均在n/p比为20:1时完全包载sirna;细胞摄取试验分析显示两种纳米复合物能够成功地将sirna转染到肿瘤细胞;且自制载体sr/srp2k介导sirna转染细胞能力与市售产品(lipofectamine2000)不存在统计学差异(p0.05)。结论:1本文成功合成了载体材料sa-r8-peg2000和sa-r8-peg5000,且方法简便易行,重现性较好。2通过静电相互作用成功制备了载sirna的纳米复合物,且方法操作简便,重现性较好。通过粒径、电位的测定及凝胶电泳试验证明复合物能够成功包载模型药物sirna。3细胞摄取试验表明,相比游离sirna,当n/p为20:1时,两种复合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna和(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/siRNA明显提高了siRNA的细胞摄取;且自制载体SR/SRP2K(载体SA-R8/SA-R8-PEG200020%的缩写)的siRNA细胞转染效果达到市售产品(Lipofectamine 2000)水平。今后将继续对该递药系统的处方、工艺进行优化,进一步提高其转染效率,以期为肿瘤治疗提供新的方法。
[Abstract]:In recent years , RNA interference has been widely studied in gene therapy and gene therapy , and it has been developed into a more mature technology . The particle size and potential of the complexes were determined by using nano - particle size and zeta potential analyzer .
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

【参考文献】