EYA-1在应激反应中的作用机制及复方左卡尼汀的药理和毒理作用

发布时间：2018-06-18 13:52

  本文选题：秀丽新杆线虫 + EYA-1　； 参考：《吉林大学》2014年博士论文

【摘要】：第一篇：转录调节因子EYA（eye absent）是一类进化上相对保守的基因家族，其C端为编码271个氨基酸的EYA结构域。最早发现EYA是控制果蝇眼部发育的基因，随后在线虫、鱼、鸟、鼠、人等动物中相继发现了一系列EYA基因。目前已经发现EYA能够参与到多重器官的发育、先天免疫、DNA损伤修复、血管形成和癌症转移。在果蝇中，EYA-1的基因突变会导致复眼发育的障碍。在人类中，EYA突变还可导致一种原发疾病称为branchio oto renal (BOR)综合症，并且在许多癌症中都有EYA的过表达。线虫体内只有一个EYA蛋白，即EYA-1。为了进一步研究EYA蛋白的生物学功能，我们选择线虫作为模式生物，用RNA干扰技术，对线虫EYA-1蛋白的功能进行了研究。 我们首先设计出线虫EYA-1的引物，利用合成的引物，将EYA-1基因从线虫的cDNA文库中扩增出来，克隆到pGex-2T表达载体中，最后转化到E.coliBL21codonplus pLysS，得到高效表达。然后，我们将EYA-1的一段基因序列克隆到pPD129.36质粒上，并转化到大肠杆菌HT115中构建出能表达EYA-1dsRNA的工程菌，将其喂养线虫，经Western Blot检测后发现，野生型线虫N2经干扰后，EYA-1蛋白的表达明显受到了抑制，RNA干扰得到了成功。 我们应用RNAi技术干扰EYA-1蛋白在野生型线虫中的表达，进一步通过免疫组织化学染色的研究，证明了EYA-1蛋白主要在线虫的肌肉系统中表达。此外，我们还发现，，EYA-1能够影响线虫的应激抵抗能力。在正常的培养条件下，干扰野生型线虫EYA-1的表达，线虫的寿命没有明显变化。但是在25℃、30℃、35℃的热激条件下，干扰线虫体内EYA-1的表达，能够显著缩短线虫的寿命，并且具有温度的依赖性。尤其在35℃时，干扰EYA-1的表达能够缩短线虫寿命达16.8%。原因在于在热激的条件下，干扰了线虫体内EYA-1的表达能够降低热休克蛋白hsp-16.2的表达量。在氧化应激的条件下，干扰线虫体内EYA-1的表达能够缩短线虫的寿命达18.7%，原因在于干扰后，线虫体内清除自由基能力的减弱以及超氧化物歧化酶sod-3的下调。并且，在氧化应激的条件下，干扰EYA-1的表达能够提高线虫体内脂褐素的累积。此外，本研究还以转基因突变株CL4176和AM140为模型，研究了干扰EYA-1的表达对于阿尔茨海默症和亨廷顿舞蹈病的影响，研究表明干扰EYA-1的表达能够加速Aβ1 42蛋白质毒性和polyQ介导的瘫痪行为的发生。最后，我们对EYA-1影响线虫应激抵抗能力的机制进行了研究。我们发现EYA-1影响线虫的应激抵抗能力与FOXO转录因子daf-16有着密切的关系。在热应激和氧化应激的条件下，干扰线虫EYA-1的表达虽然不能抑制daf-16的核内定位，但是对于daf-16敲除缺陷株的寿命却没有明显改变，说明EYA-1可能是作用在daf-16的下游，并且EYA-1控制线虫的应激抵抗能力需要借助转录因子daf-16的帮助。半定量PCR的结果显示，干扰了线虫体内EYA-1的表达能够下调daf-16靶基因mRNA的水平，如hsp-12.3和sod-3。这些实验结果表明，EYA-1能够参与到daf-16介导的应激抵抗力中，并且作用在daf-16的下游，通过调节应激抵抗相关基因，影响线虫的应激抵抗能力，本实验为研究EYA蛋白的功能提供了新的方向。 第二篇：复方左卡尼汀注射液是由左卡尼汀和曲美他嗪按照200:1的配比组成，其中左卡尼汀的主要作用是促进脂酰-CoA进入线粒体，从而促进脂肪酸的氧化；曲美他嗪的作用是通过抑制β-氧化中3-KAT酶的活性，抑制脂肪酸代谢，促进葡萄糖氧化，利用有限的氧，产生更多的ATP，增加心脏的收缩功能。在动物实验中发现，这两种作用机制完全相反的药物在大鼠和犬的心梗模型上显示出了非常显著的抗缺血，缩小心梗面积的协同作用。 本研究以秀丽新杆线虫作为模式生物，首先研究了0.1%左卡尼汀、0.0005%曲美他嗪，以及两种单药的复方药物复方左卡尼汀对连续三代线虫寿命以及生殖能力的影响。结果表明，0.1%左卡尼汀、0.0005%曲美他嗪以及复方左卡尼汀对于连续三代线虫的寿命均无明显影响。不同浓度的左卡尼汀、曲美他嗪以及不同浓度配比的复方左卡尼汀对于线虫寿命也均无明显影响，说明该三种药物对线虫不具有药物毒性。在产卵组实验中，左卡尼汀和曲美他嗪对于亲代、F1代、F2代线虫的生殖能力均有着不同程度的负面影响。而复方左卡尼汀对于线虫的生殖能力不但没有体现出负面影响，反而起到了一定的保护作用。饮食限制能够减少线虫的产卵量，并且饮食限制与线虫的脂肪累积有着密不可分的关系。通过对线虫总脂肪进行油红O染色和气相色谱分析发现，左卡尼汀和曲美他嗪能够减少线虫体内的脂肪累积和总脂肪酸的含量，而复方左卡尼汀对线虫体内脂肪累积和总脂肪酸含量无明显影响。本研究为复方左卡尼汀的药理以及毒理作用提供了理论依据。
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本文编号：2035700