髓过氧化物酶响应性纳米粒的构建及在炎症成像和治疗中的应用研究

发布时间：2018-06-18 15:45

  本文选题：鲁米诺 + β-环糊精　； 参考：《第三军医大学》2016年博士论文

【摘要】：响应性纳米材料的设计和合成一直是纳米医学关注的热点问题。纳米载体不仅具有改善药物组织分布,影响药物体内代谢的特点,还能实现诊断、治疗等功能的一体化。但如何使药物能够特异性的分布于病灶和靶标部位,就需要更加有效的递送策略。自上世纪70年代首次提出响应性纳米递送系统的理念后,已有大量实验和应用研究取得了诸多进展。利用温度、磁场、光照等外源性刺激和pH、酶、氧化还原系统等诸多内源性物质的改变,使药物及成像、诊断试剂能够特异性的分布和富集于靶标部位,用于诸如炎症、心血管功能障碍及肿瘤等多类疾病的诊断和治疗。当前研究中,外源性信号响应性纳米递送系统因需施加后续外源性干预,过程相对较为繁琐,长期应用性也较为困难;而在内源性信号响应性纳米递送系统中,基于疾病微环境改变,具备诊断和治疗功能的纳米材料,虽多有研究,但同时具有酶响应性无创成像能力,且具备治疗特性的纳米递送系统亦鲜有报道。基于以上问题,本课题提出设想:以小分子发光物质鲁米诺(luminol)为功能单元,将其键合于FDA批准的生物相容性分子β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD),可以得到髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)响应性的化学发光材料bCD-Lu;以其制备化学发光纳米粒(Nanoparticle,NP),用于炎症的无创成像。为验证此假设,在成功合成bCD-Lu的基础上,对其纳米粒的理化性能和体外发光特性进行了深入表征。同时,基于多种急性炎症模型对bCD-Lu纳米粒的体内成像功能进行了深入评价,并在多种炎症模型中研究了其治疗效果。由此,成功构建了具有MPO响应性的多功能纳米递送系统。方法1.Luminol键合β-CD功能材料bCD-Lu的合成称取0.68 gβ-CD和0.68 g N,N'-carbonyldiimidazole(CDI)于圆底烧瓶中,加入6m L无水DMF溶解并以N2保护,室温下搅拌1.5 h后,将反应混合物缓慢加入4℃无水乙醚中沉淀,抽滤后,将沉淀重新加入8 m L无水DMF中溶解,并称取0.318 g luminol加入其中,室温下搅拌反应15 h。随后,将产物缓慢加入蒸馏水中沉淀,8500 rpm离心6 min,弃去上清液,加入25 m L蒸馏水涡旋清洗2次、并离心收集,冷冻干燥2天,得bCD-Lu白色粉末。2.bCD-Lu及水解产物的表征取bCD-Lu溶于DMSO-d6,扫描核磁氢谱和碳谱;取bCD-Lu粉末适量,设定分辨率16 cm-1,扫描次数4次,测试范围650-4000 cm-1扫描红外光谱;将bCD-Lu溶于1 M Na_2CO_3溶液,加入H_2O_2后200-800 nm扫描化学发光光谱;将bCD-Lu分别溶于1 M Na_2CO_3溶液和DMSO中,扫描紫外光谱。bCD-Lu溶解于1 M Na_2CO_3溶液反应2h,丙酮沉淀后,溶于DMSO-d6,扫描核磁氢谱。3.bCD-Lu纳米粒(bCD-Lu NP)的制备和表征将bCD-Lu 50.0 mg,加入2 m L DMF搅拌溶解,缓慢加入10 m L蒸馏水,室温下搅拌2 h后,12000 rpm离心10 min,弃去上清,加入2 m L蒸馏水水洗3次后得bCD-Lu NP。少量水分散后,采用透射电子显微镜观察纳米粒形态,并测定其粒径和电位。4.bCD-Lu NP在不同pH和不同浓度H_2O_2溶液中的稳定性取bCD-Lu NP溶液加入pH 1.0~14的水解介质中,500 nm处测定溶液的透光率,并收集相应时间点的水解数据。另取纳米粒溶液加入含有1~800 m M H_2O_2的水解介质中,测定不同时间点500 nm处的透光率。5.H_2O_2浓度对bCD-Lu NP化学发光光谱和强度的影响在石英比色皿中加入bCD-Lu NP和鲁米诺钠盐(luminol-Na)后,加入0~100 m M不同浓度的H_2O_2,扫描bCD-Lu NP化学发光光谱。在透明光学玻璃样品池中加入bCD-Lu NP和luminol-Na,加入0~10 m M H_2O_2,微弱发光测量仪测定发光强度-时间变化曲线。6.MPO和Cl~-水平对bCD-Lu NP化学发光光谱和强度的影响在石英比色皿中和玻璃样品池中加入bCD-Lu NP和luminol-Na后,按照方案PBS+H_2O_2,PBS+MPO+H_2O_2和MPO+NaCl+H_2O_2加入MPO、Cl~-,随后加入H_2O_2观察纳米粒的化学发光光谱变化并记录强度-时间变化曲线。以同样的方法测定NaCl O对bCD-Lu NP发光行为的影响,其中NaClO的浓度在0~1 m M之间。7.bCD-Lu NP浓度对其化学发光光谱和强度的影响将0~6 mg/m L的bCD-Lu NP样品加入等体积的1 m M H_2O_2后观察纳米粒的化学发光光谱变化;移取0~10 mg/m L的bCD-Lu NP溶液于样品池中,加入等体积的10 m M H_2O_2,测定纳米粒发光强度变化。8.MPO抑制剂和活性氧清除剂对bCD-Lu NP发光强度的影响在样品池中加入bCD-Lu NP后,加入等体积MPO和1~10μM MPO抑制剂对氨基苯甲酰肼(4-Aminobenzoic acid hydrazide,4-ABAH)或0~1000μM活性氧清除剂哌啶醇氧化物(4-Hydroxy-TEMPO,TEMPOL),随后,加入等体积的10 m M H_2O_2测定bCD-Lu NP发光强度的变化。9.孔板成像考察H_2O_2对bCD-Lu NP发光特性的影响吸取bCD-Lu NP溶液于黑色96孔板中,分别加入0~1 m M H_2O_2样品溶液,共12孔,随后,以IVIS成像系统测定化学发光强度,其中曝光时间为5 min。10.孔板成像考察MPO、Cl~-及bCD-Lu NP浓度对其发光行为的影响在黑色96孔板中加入bCD-Lu NP,将0~100 m U/m L的MPO溶液或0~200 m M Na Cl+200 m U/m L MPO溶液移入孔板,随后,加入200μM H_2O_2以相同条件进行IVIS成像。吸取0~10 mg/m L bCD-Lu NP溶液于黑色96孔板中,加入1 m M H_2O_2后立即成像。11.孔板成像研究MPO抑制剂和活性氧清除剂对bCD-Lu NP发光的影响在黑色96孔板中加入bCD-Lu NP后,加入等体积MPO和0~10.24μM 4-ABAH或0~40μM TEMPOL,随后,加入等体积200μM H_2O_2记录bCD-Lu NP发光强度值。12.bCD-Lu NP在中性粒细胞中的发光行为研究Balb/c小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐溶液,4 h后处死小鼠,腹腔注射HBSS,5 min后,抽取腹腔灌洗液,离心弃上清,HBSS清洗2次,重悬获得中性粒细胞。12孔板每孔接种5.0×10~5细胞,加入佛波酯刺激,1 h后,分别加入bCD-Lu NP和luminol-Na成像,通过IVIS系统成像。13.bCD-Lu NP在足趾肿胀模型中的成像功能评价取Balb/c小鼠,于左后侧足趾部位局部注射0.2%角叉菜胶溶液建立模型,造模6h后,分别局部注射bCD-Lu NP和lumiol-Na(含量按luminol单元计算为0.75 mg/kg),并采用IVIS进行成像。随后,以地塞米松(Dexamethasone,DEX)干预模型,再次观察纳米粒的成像效果。14.bCD-Lu NP在腹膜炎模型中的成像效果研究取Balb/c小鼠腹腔注射0.1%脂多糖建立模型,6 h后,腹腔注射bCD-Lu NP和lumiol-Na(含量按luminol计算为7.5 mg/kg),并进行IVIS成像。此外,Balb/c小鼠腹腔注射0.1%脂多糖,3%巯基乙酸盐或0.1%酵母多糖溶液建立腹膜炎模型。6 h后,注射0.5 m L bCD-Lu NP(按luminol单元剂量为7.5 mg/kg),进行IVIS成像,并测定小鼠腹腔灌洗液中中性粒细胞的比例。以0.1%酵母多糖为刺激物建立腹膜炎模型,测定模型小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)白介素-1β(IL-1β)的水平。随后给予bCD-Lu NP,观察发光强度随时间的变化;同时测定腹腔灌洗液中中性粒细胞比例、MPO和活性氧(ROS)含量。此后,分别在成像前注射500μM 4-ABAH和12.8μM TEMPOL,考察抑制剂对发光强度的影响。15.bCD-Lu NP在急性肺损伤模型中的发光行为研究取Balb/c小鼠通过鼻腔呼吸道吸入0.1%脂多糖溶液建立急性肺损伤模型,6 h后,尾静脉注射bCD-Lu NP和lumiol-Na(含量按luminol计算为3 mg/kg),进行IVIS成像。并取PBS肺部灌洗液和肺组织测定MPO、ROS、TNF-α和IL-1β的含量。随后,建立0~24 h不同时间点肺损伤模型,给予bCD-Lu NP(含量按luminol计算为3 mg/kg),考察发光强度和炎症进程的关系,同时测定肺组织中性粒细胞比例以及MPO和ROS含量。16.bCD-Lu NP在结肠炎模型中的成像效果评价取C57BL/6J小鼠给予3%葡聚糖硫酸酯钠盐(DSS)水溶液建立结肠炎模型,于模型建立第1,3,7天后,直肠给予bCD-Lu NP进行IVIS成像,并同时测定结肠部位MPO和ROS含量。17.载DEX的bCD-Lu NP对小鼠足趾肿胀治疗作用的评价制备负载DEX的bCD-Lu纳米粒(DEX/bCD-Lu NP),同时选择聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为对照材料制备负载DEX的纳米粒(DEX/PLGA NP),对其进行表征。取Balb/c小鼠,测厚仪测量小鼠足趾部位厚度,于左后侧足趾部位局部注射0.2%角叉菜胶溶液建立模型。造模0.5 h后,给予DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP(按DEX剂量为2.5 mg/kg)。6 h后,测量小鼠足趾厚度,同时收集成像图片。此后,小鼠足趾部位给予50μL luminol-Na溶液,再次进行成像。18.DEX/bCD-Lu NP对小鼠腹膜炎治疗作用的评价取Balb/c小鼠腹腔注射0.1%酵母多糖建立模型,0.5 h后,腹腔注射给予DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP(按DEX剂量计算为2.5 mg/kg)进行干预。6 h后,取腹腔灌洗液测定其中中性粒细胞比例以及MPO、ROS、TNF-α和IL-1β的水平。19.DEX/bCD-Lu NP对小鼠急性肺损伤治疗作用的研究取Balb/c小鼠,通过鼻腔呼吸道吸入0.1%脂多糖溶液建立急性肺损伤模型,0.5 h后,尾静脉注射DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP(按DEX剂量计算为2.5 mg/kg)进行干预。12 h后,取肺组织灌洗液测定其中中性粒细胞比例以及MPO、ROS、TNF-α和IL-1β含量。同时测定肺组织中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平。20.bCD-Lu NP对小鼠动脉粥样硬化的治疗作用评价取载脂蛋白E缺陷(Apo E-/-)小鼠,喂养高脂饲料(5%猪油和0.25%胆固醇)建立动脉粥样硬化模型,1月后,腹腔注射给予Cy7.5标记的bCD-Lu纳米粒(Cy7.5/bCD-Lu NP),给药12天后处死小鼠,剥离主动脉进行IVIS成像观察纳米粒在主动脉斑块部位的富集情况。治疗实验中,给予高脂饮食1月后,腹腔注射给予生理盐水和bCD-Lu NP(30 mg/kg)直至实验结束,每隔3天给药一次,记录小鼠体重变化。3个月后,取小鼠全血和血清测定血常规、血脂和肝肾功能指标,同时测定小鼠血清炎症因子。取小鼠主动脉至腹主动脉分叉段,0.3%油红O染色,尼康Nis-Elements BR3.2软件统计斑块面积。此外,以组织消化液消化主动脉,加入V450抗CD11b和PE抗Ly6G小鼠抗体,流式细胞仪测定主动脉组织中中性粒细胞含量。另外,取主动脉根部冰冻切片,进行Masson染色,并与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD68抗体分别进行孵育染色,以软件统计相应面积。21.bCD-Lu NP的细胞毒性评价于96孔板中每孔加入1×105巨噬细胞RAW264.7或乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞,加入浓度为3.9~1μg/m L的bCD-Lu NP溶液。孵育24 h后,加入培养基90μL和MTT 10μL,酶标仪490 nm除测定吸光度值,计算细胞存活率。22.bCD-Lu NP的初步体内安全性评价昆明小鼠称重后,尾静脉注射给予600 mg/kg bCD-Lu NP。注射后,每2天记录体重,观察其基本生命体征。15天后,小鼠处死后取血样测定血常规,并取血清,测定谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐和尿素肝肾功指标。并取小鼠主要脏器,计算脏器指数,同时进行组织病理学分析。结果1.基于β-CD和luminol合成了功能材料bCD-Lu,并对材料进行了红光光谱、核磁氢谱和碳谱表征,其水解产物核磁氢谱显示β-CD与luminol的摩尔比为1:1。与luminol化学发光光谱和紫外光谱相比,材料的最大发射峰和吸收峰没有发生位移。2.通过纳米沉淀法制备了发光纳米粒bCD-Lu NP,其粒径为220 nm,Zeta电位为-25 m V。3.bCD-Lu NP在pH2或9.2溶液中能够快速分解,伴随H_2O_2浓度的增高,其水解逐渐加快。当H_2O_2浓度提高至50 m M时,纳米粒快速水解,1.5 h后,溶液透光率即提高至23%。4.与luminol-Na相比,bCD-Lu NP在H_2O_2溶液中的化学发光光谱未发生变化,最大发射峰位置与luminol-Na一致;而在相同条件下,bCD-Lu NP的发光强度和持续时间均显著增加;随双氧水浓度的提高,bCD-Lu NP的发光强度具有H_2O_2响应性,与H_2O_2浓度成正相关。5.bCD-Lu NP溶液的光谱学研究和孔板成像结果显示,逐一加入MPO和Cl-后,发光强度逐步升高,并具有突跃性,强度升高程度和MPO以及Cl-浓度成依赖性,最大发射峰位置未发生改变。纳米粒溶液在加入NaClO溶液后,发光强度升高,强度与NaClO浓度呈正相关。6.bCD-Lu NP溶液的化学发光强度变化呈现浓度依赖性,纳米粒浓度升高,发光强度逐渐增大,最大发射峰位置不变。7.bCD-Lu NP溶液的发光强度在加入MPO抑制剂4-ABAH和ROS清除剂TEMPOL后,受到显著抑制,表明其发光具有MPO和ROS响应性。8.bCD-Lu NP在小鼠足趾肿胀模型中具有良好的成像功能,与luminol相比,其成像具有缓慢增加,不断增强的趋势,具有显著延长的小鼠体内成像时间;而在DEX干预后,成像效果受到明显抑制,说明纳米粒的成像与炎症的程度息息相关。9.bCD-Lu NP在腹膜炎模型中的成像效果良好,其发光时间延长的结果与足趾肿胀模型一致。在脂多糖、巯基乙酸盐和酵母多糖三种刺激物诱导的小鼠腹膜炎模型中,纳米粒的发光与腹腔灌洗液中的中性粒细胞数呈显著正相关,R值为0.99。酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎中,成像时间点考察结果与腹腔灌洗液中中性粒细胞比例及MPO、ROS含量呈现明显的相关性;而在加入抑制剂4-ABAH和TEMPO后,动物体内发光受到抑制,亦证明bCD-Lu NP的体内发光具有MPO和ROS依赖性和响应性。10.在小鼠急性肺损伤模型中,bCD-Lu NP成像表现出独特的优点,与其相比,luminol组均无明显的发光。通过在不同时间点对肺损伤小鼠进行在体成像,并测定肺组织中的中性粒细胞比例及MPO、ROS含量,结果显示,发光强度与后者表现出依赖性和响应性。11.bCD-Lu NP在小鼠结肠炎模型中亦表现出一定的发光特性,强度相对较弱;但通过测定结肠部位MPO和ROS含量,亦发现,其发光强度和二者变化趋势一致。12.通过纳米沉淀法制备了载药纳米粒DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP,粒径分别为240和190 nm,Zeta电位为-30和-36 m V。在小鼠足趾肿胀模型中,通过测定小鼠足趾肿胀厚度及成像结果表明,DEX/bCD-Lu NP具有良好的治疗效果,且证明了bCD-Lu NP同时具有成像和药物递送功能。13.DEX/bCD-Lu NP能够有效抑制小鼠腹膜炎的进展,在纳米粒治疗组,腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例、MPO、ROS及炎症因子TNF-α和IL-1β都有显著性降低。14.在小鼠急性肺损伤模型的治疗研究中,DEX/bCD-Lu NP也表现出良好的治疗效果。通过测定肺灌洗液中的中性粒细胞比例、MPO、ROS及炎症因子TNF-α和IL-1β的含量,以及肺组织中TNF-α和IL-1β的水平,结果均表明,上述细胞和因子都有显著性降低。15.在基于Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型的治疗研究中,主动脉油红染色结果表明,在纳米粒干预组,斑块面积有所减少,和对照组相比,有显著性差异。中性粒细胞流式分析以及冰冻切片免疫组化染色结果表明,在纳米粒干预组,中性粒细胞数和MPO水平均有所减少。冰冻切片巨噬细胞和斑块胶原染色统计结果表明纳米粒能够有效提高斑块的稳定性。上述结果说明bCD-Lu NP对动脉粥样硬化具有较好的治疗效果。16.初步bCD-Lu NP的细胞毒性和小鼠急性毒性试验结果显示,bCD-Lu NP具有良好的体内外安全性。在600 mg/kg剂量下,动物体重、脏器指数、血常规及肝肾功等指标与对照组相比,无显著性差异。结论1.成功合成了髓过氧化物酶响应性化学发光材料bCD-Lu,并制备了相应的纳米粒;共价键结合后,bCD-Lu的发光行为未发生变化,H_2O_2、MPO和Cl-能显著提高纳米粒的化学发光强度;MPO抑制剂和ROS清除剂能显著抑制bCD-Lu NP的发光强度,故纳米粒的发光特性具有明显的MPO和ROS响应性。与luminol相比,bCD-Lu NP具有显著增强的发光强度和明显延长的发光时间。2.bCD-Lu NP能够在小鼠足趾肿胀模型中进行在体成像,且发光强度能够被DEX抑制,纳米粒的发光强度可以反映炎症的发展程度;bCD-Lu NP在小鼠腹膜炎、急性肺损伤和结肠炎模型中的发光强度与中性粒细胞数以及MPO和ROS的水平相关,具有MPO和ROS依赖性,故bCD-Lu NP的化学发光强度能够反映炎症初期的进展情况。3.bCD-Lu NP能够负载抗炎药物DEX,DEX/bCD-Lu NP在小鼠足趾肿胀、腹膜炎和急性肺损伤模型中,呈现良好的治疗效果,能显著减少疾病部位中性粒细胞的浸润、降低MPO、ROS及炎症因子TNF-α和IL-1β的水平。4.bCD-Lu NP通过降低主动脉斑块部位中性粒细胞数,减少斑块部位巨噬细胞数量,增加胶原含量,可以有效减小动脉粥样硬化斑块面积、并提高斑块稳定性。5.初步体内外评价表明bCD-Lu NP具有良好的安全性。综上所述,本论文基于β-CD和发光物质luminol合成了功能性载体材料bCD-Lu,并以其构建了MPO和ROS响应性的发光纳米载体。基于光谱测定、孔板成像、细胞成像以及活体成像和治疗等实验,证明了bCD-Lu NP在急性炎症中的成像功能和抗炎活性,为检测炎症的发生发展以及治疗提供了新的手段。此外,bCD-Lu NP的发光特性和抗炎效果具有中性粒细胞、MPO和ROS依赖性和响应性,为相关疾病诊断新试剂和治疗新药物的设计提供了新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;TB383.1
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本文编号：2035999