重组Kallistatin抗肿瘤血管生成活性及其分子机制研究

发布时间：2018-06-23 19:29

本文选题：Kallistatin + 血管生成　；参考：《华侨大学》2014年博士论文

【摘要】：血管生成是一种重要生理活动现象，包括血管内皮细胞的活化、增殖、迁移、血管基底膜破坏、形成新的血管和血管网，并且与已存在的血管网连接。尤其在实体瘤的生长过程中，血管生成为肿瘤的生长提供必要的营养供给。随着肿瘤血管生成概念的提出，以肿瘤血管生成为药物靶点，为抗癌药物研发奠定了理论基础，开发应用高效的抑制肿瘤血管生成药物在抗肿瘤治疗中显得尤为重要，成为当前抗肿瘤药物研制的重要方向之一。 Kallistatin（Kal）又称组织激肽释放酶结合蛋白，具有独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，随后发现其参与高血压、炎症、血管生成、肿瘤等多种疾病的发生和发展过程，是一个极具临床应用前景的蛋白类药物。目前对Kal抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤生长的能力已被证实，但是其确切的分子作用机制尚不清楚，本研究将通过酵母菌发酵并纯化得到重组Kallistatin蛋白（rhKal），通过体内外的实验研究验证其抗肿瘤血管生成的药理活性，并进一步研究其分子作用机制。首先将含有pPIC9-Kal质粒的GS115(His4)菌体，用甲醇诱导培养基诱导表达，离心后留上清，然后经过疏水作用（Phenylsepharose TM）、凝胶过滤层析（Sephade TMG-25）和亲和层析（Heparin Sepharose）分离纯化制备出rhKal蛋白纯品，并进行验证。其次，以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为研究对象，通过体内外的实验研究，考察在血管内皮生长因子（VEGF）刺激作用下，人源重组Kallistatin对HUVEC增殖、迁移、侵袭、小管生成等生物活性的影响，，并初步研究了rhKal对VEGF介导的VEGFR-2受体活性及下游信号通路活化的影响，进而了解rhKal抗血管生成的分子机制。再次，为了明确rhKal对肿瘤血管生成的影响，体外模拟了肿瘤环境，体内外实验观察rhKal对乳腺癌MCF-7细胞株刺激的HUVEC血管生成的作用，进一步研究了人源重组Kal抗肿瘤血管作用与NF-κB信号通路之间的关系。通过检测了不同浓度rhKal对乳腺癌MCF-7细胞和HUVEC细胞P65、I-κBα、磷酸化I-κBα、IKK蛋白及其磷酸化的影响，进一步利用western-blotting法检测P65、P50核转位变化，利用报告基因技术研究对P65蛋白转录活化的影响；同时检测了rhKal对NF-κB传导通路调节的血管生成相关基表达的影响。最后，为了进一步验证rhKal抗血管生成作用和NF-κB之间的关系，我们构建了p65基因真核表达质粒，分别导入乳腺癌MCF-7细胞和HUVEC细胞，观察外源性p65基因对细胞凋亡、侵袭，以及对rhKal蛋白抑制血管生成相关基因的影响。以上的研究结果表明，rhKal明显抑制了VEGF诱导的血管生成，其分子机制部分可能与阻断了VEGFR-2信号通路相关；在体外肿瘤环境中，rhKal同样可以抑制了乳腺癌细胞对血管生成的促进作用，其分子机制可能与rhKal阻断了NF-κB信号通路相关，从而抑制了其下游与血管生成相关靶基因的表达。综上所述，整体结果表明rhKal具有明显的抗肿瘤血管作用，是一个极具应用前途的抗肿瘤血管生成作用蛋白类药物。
[Abstract]:angiogenesis is an important physiological activity phenomenon , including activation , proliferation , migration of vascular endothelial cells , destruction of vascular basement membrane , formation of new blood vessel and vascular network , and connection with existing vascular network .

Kallistatin ( Kal ) , also known as the kallistatin ( Kal ) , has a unique serine protease inhibitor activity , and has been found to be involved in the development and development of various diseases such as hypertension , inflammation , angiogenesis , tumor , etc .

The effects of rhKal on the proliferation , migration , invasion and formation of vascular endothelial growth factor ( VEGF ) in human breast cancer MCF - 7 cells were investigated .
Finally , in order to further verify the relationship between rhKal anti - angiogenic effect and NF - 魏B , we constructed a eukaryotic expression plasmid of p65 gene , introduced into MCF - 7 cells and HUVEC cells of breast cancer , respectively , observed the effects of exogenous PKP gene on apoptosis , invasion and inhibition of angiogenesis - related genes .

The results showed that rhKal inhibited VEGF - induced angiogenesis , and its molecular mechanism might be related to the blocking of VEGFR - 2 signaling pathway .
In conclusion , rhKal can inhibit angiogenesis in breast cancer cells . The molecular mechanism of rhKal can block the expression of NF - 魏B signal pathway downstream from rhKal . In conclusion , it is shown that rhKal has obvious anti - tumor angiogenesis and is a promising anti - tumor angiogenesis agent .
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ460.1;R96

【参考文献】