两种海洋微藻多糖抑制肿瘤血管生成活性的研究

发布时间：2018-07-17 03:21

【摘要】：本文以米氏凯伦藻、小球藻两种海洋微藻为材料,优化了米氏凯伦藻多糖的制备工艺,经乙醇分级沉淀获得微藻多糖,并对微藻多糖进行抑制肿瘤血管生成活性及在分子水平上研究其对相关蛋白的表达。通过比较索氏提取法、超声提取法、闪式破碎提取法、闪式破碎结合蛋白酶水解法对米氏凯伦藻多糖提取率的影响,选择闪式破碎结合酶解方法提取多糖,优选碱性蛋白酶进行酶解,确定米氏凯伦藻多糖酶解较优的提取条件为:酶解温度40℃、酶解pH 8.5、酶用量为藻粉重量的2.5%、酶解时间为2h,在此条件下米氏凯伦藻多糖的提取率可达9.71%。30%、50%、80%乙醇分级沉淀依次获得米氏凯伦藻多糖组分KPS1、KPS2、KPS3和小球藻多糖组分CPS1、CPS2、CPS3。采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型实验,对上述微藻多糖进行活性筛选,筛选出KPS1、KPS2、CPS1、CPS2均具有抑制血管生成的潜在作用。采用MTT法(四氮唑蓝试验)测定发现,六种微藻多糖对正常状态下人脐静脉内皮细胞的生长基本没有毒性。10%的人肝癌细胞培养液能够明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖,而米氏凯伦藻多糖和小球藻多糖能够在一定程度上拮抗肿瘤细胞培养液对人脐静脉内皮细胞生长的诱导作用。通过细胞划痕愈合实验(Wound Healing assay)发现10%人肝癌细胞培养液能够明显促进人脐静脉内皮细胞的迁移,米氏凯伦藻多糖中KPS1、KPS2能拮抗其诱导作用,一定浓度范围内其抑制作用呈现剂量依赖关系。小球藻多糖中CPS1、CPS2对肝癌细胞诱导的人脐静脉内皮细胞迁移抑制作用较为突出,其中CPS2在5μg/m L-100μg/mL浓度范围内呈良好的浓度梯度趋势。通过WesternBlot实验发现,肝癌细胞诱导的人脐静脉细胞MMP-9和VEGF相关蛋白表达量增高,米氏凯伦藻多糖KPS1在100μg/mL时对MMP-9的表达具有显著的抑制作用(P0.05)推测米氏凯伦藻多糖可能是通过抑制内皮细胞中MMP-9相关蛋白的表达来实现其抑制肿瘤血管生成的活性。米氏凯伦藻多糖KPS2、KPS3均有不同程度的抑制诱导其VEGF相关蛋白表达的增加,其中KPS2在浓度50μg/mL、100μg/m L中均有显著抑制作用。小球藻多糖并没有明显的抑制人脐静脉内皮细胞中MMP-9相关蛋白的表达,推测小球藻多糖抑制肿瘤血管生成活性可能不是通过MMP-9因子相关蛋白的表达来实现的。小球藻多糖均有不同程度的降低HUVECs中VEGF蛋白的表达,其中以CPS1和CPS3在浓度为100μg/mL下具有较为显著的抑制作用,提示小球藻多糖具有一定的抑制内皮细胞HUVECs中VEGF蛋白的表达。在对VEGF的受体VEGF-R1进行进一步研究发现,浓度为100μg/mL的CPS1和50μg/mL、100μg/mL的CPS2具有显著的抑制作用,表明小球藻多糖对肝癌细胞诱导的内皮细胞HUVECs中VEGF-R1蛋白的表达具有一定的抑制作用。
[Abstract]:In this paper, two kinds of marine microalgae, Karen's and Chlorella, were used as materials to optimize the preparation process of the polysaccharides from Karen's algae and Chlorella micronuginosa. The polysaccharides were obtained by ethanol fractionation. Microalgae polysaccharides were used to inhibit tumor angiogenesis and to study the expression of related proteins at molecular level. By comparing the effects of Soxhlet extraction, ultrasonic extraction, flash crushing combined with protease hydrolysis on the extraction rate of polysaccharides from Kellenella mirabilis, the polysaccharides were extracted by flash crushing combined with enzymatic hydrolysis. Alkaline protease was selected for enzymatic hydrolysis, and the optimum extraction conditions were determined as follows: the temperature of enzymatic hydrolysis was 40 鈩，

本文编号：2128784