肺表面活性蛋白B前肽proSP-B的重组表达及抗菌活性研究

发布时间：2018-07-22 13:19

【摘要】：proSP-B(Precursor Surfactant Protein B)是肺表面活性蛋白B的前肽,其作为一个前体蛋白,在形成和调节肺表面活性蛋白B的形成过程中发挥着极其重要的作用。由于pro SP-B蛋白氨基酸序列的疏水性和其结构的独特性,研究学者将其归为鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-Like Proteins,SAPLIPs)超家族的一员,SAPLIPs家族成员作为一类具有独特结构的蛋白族群,具有非常广谱的生物学功能,而抗菌活性是其最为重要的功能之一。而近几年来,随着抗生素在食品及医药卫生领域的滥用及不合理使用,引起了耐药、泛耐药、交叉耐药,甚至是超级细菌的不断出现,使得抗感染问题变的越来越严峻,而抗生素的毒副作用也使得人类的健康及生命安全面临极大威胁。因此,开发一类新的高效,低毒,具有新的抗菌作用机制的药物迫在眉睫。抗菌肽作为一类由生物体自身生理活动产生的,具有广谱抗菌活性的小分子物质,日渐成为替代传统抗生素的一类新型抗菌药物。在本实验研究中,我们利用基因工程技术构建了pGEX4T-1-pro SP-B原核表达载体,并用IPTG成功诱导表达并纯化出pro SP-B蛋白,分析pro SP-B蛋白在CCL149细胞中的定位和毒性作用,为pro SP-B蛋白的抗菌作用及作用机理奠定基础;接着滤纸片法检测pro S-B蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抗菌活性,再以金黄色葡萄球菌为试验菌,考察蛋白的抗菌作用机理,为开发新型的抗菌药物奠定基础。研究目的:本课题旨在研究通过基因工程技术构建、表达、纯化获得pro SP-B重组蛋白,分析其毒性和抗菌活性及抗菌机制,为将pro SP-B开发成一种新型的抗菌药物奠定理论和实验基础。研究方法:(1)构建pGEX4T-1-pro SP-B原核表达载体,分析pro SP-B融合表达特性。proSP-B的氨基酸序列疏水性较强,较难通过化学合成的方式获得,实验中通过基因工程的方法将目的基因pro SP-B构建到pGEX4T-1质粒上,然后利用IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western Blot检测pro SP-B的表达,并纯化获得pro SP-B蛋白。(2)考察pro SP-B蛋白的细胞荧光定位及细胞毒性。构建真核表达载体pEGFP-N2-pro SP-B,然后将真核表达载体转染到CCL149细胞中,利用载体上携带的GFP基因,结合DAPI核染与DiI细胞膜染色,分析pro SP-B在细胞中的定位。将CCL149细胞与pro SP-B蛋白共孵育考察proSP-B蛋白的细胞毒性。(3)proSP-B蛋白的抗菌活性研究。培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌,然后用滤纸片扩散法考察pro SP-B蛋白的抗菌活性及抗菌谱。(4)proSP-B蛋白抗菌机理研究。选用金黄色葡萄球菌作为考察试验菌,利用碘化丙啶(PI)染色法和乳酸脱氢酶(LDH)酶活测定的方法研究分析pro SP-B蛋白的抗菌机理。研究结果:(1)成功构建了pro SP-B原核表达载体,并采用在延长表达时间的方法,成功促进重组pro SP-B蛋白的可溶性表达,并纯化了pro SP-B蛋白,应用BCA法测定其蛋白浓度为1 mg/mL。(2)利用分子生物学技术成功构建了融合表达载体pEGFP-N2-pro SPB,发现GFP-pro SP-B表达的绿色荧光蛋白主要定位在CCL149细胞的细胞膜上,而单独表达GFP的绿色荧光则分布在CCL149细胞的细胞胞质中,说明pro SP-B能在CCL149细胞中特异性表达,并定位在细胞膜上而发挥其膜结合性功能。(3)利用蛋白与细胞共培养的方式确定了proSP-B蛋白的细胞毒性,其IC50约为1595?g/mL,根据细胞毒性分级评价标准初步确定pro SP-B蛋白的细胞毒性是低毒的。(4)通过滤纸片法成功测定了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌对pro SP-B蛋白的敏感性,并分别计算出其MIC值。发现pro SP-B蛋白对细菌、真菌均具有一定的抑制作用,且对革兰阳性菌的作用大于革兰氏阴性菌,对细菌的作用大于真菌。(5)以金黄色葡萄球菌作为实验对象,应用PI荧光染色及LDH酶活法初步测定分析pro SP-B蛋白的抗菌机理,结合pro SP-B的细胞荧光定位,我们初步得出proSP-B发挥其抗菌活性的作用机理是pro SP-B蛋白作用于细菌的细胞膜,通过改变细菌的膜结构而影响细菌细胞膜的保护和调节作用,从而抑制或杀死细菌的。
[Abstract]:ProSP - B ( proSP - B ) is a propeptide of lung surface active protein B . As a precursor protein , it plays an important role in the formation and regulation of lung surface active protein B . The anti - bacterial activity of pro SP - B protein was investigated . The expression of pro SP - B protein was investigated . The expression of pro SP - B protein was investigated by means of gene engineering . ( 3 ) The effect of pro SP - B protein on the cell membrane of bacteria and fungi was determined by using PI fluorescence staining and LDH enzyme activity method .
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R915

【参考文献】