基底外侧杏仁核motilin抗焦虑作用及其机制研究

发布时间：2018-07-29 07:28

【摘要】：【研究背景】据统计2010年全球约有2.73亿人患有焦虑症（anxiety disorder），约占总人口的4.5%，其中女性多于男性，分别为5.2%和2.8%。在欧洲、非洲和亚洲，终生患病率在9-16%，年患病率在4-7%之间，而在美国发病率明显提高，终生患病率约为29%，11-18%的成年人在一生当中曾经遭遇这种状态。目前认为，焦虑症的发生主要由以下几个因素引起：药物、心理因素、压力、持续性的焦虑状态、遗传和家庭因素、文化背景以及神经回路信息传递异常。这些因素中的一个或多个相互作用从而导致不同类型焦虑症的发生。经过多年的努力，人们对焦虑症的发病机制虽然有了更深入的认识，但其分子生物学基础仍不清楚。除了多种神经递质参与其中以外，研究人员也发现了与焦虑行为相关的神经网络，或许这一神经网络中的信息传递异常才是焦虑症发生的根本原因。鉴于此，有学者提出了焦虑症的细胞模型，认为病理性焦虑症是由于杏仁核起关键作用的神经环路E/I平衡(balance of excitation and inhibition)紊乱所导致的。因此，针对参与引起焦虑调节的分子，如神经递质和神经调质系统或者细胞内信号蛋白等，通过改善E/I平衡，从而产生抗焦虑作用。临床上对焦虑症的治疗主要包括改变生活方式，心理治疗和行为治疗，而只有其他治疗无效时才建议使用药物治疗。认知行为疗法（cognitive behavioral therapy,CBT）是目前最有效的焦虑症心理治疗手段，它有两个主要组成成分：认知和行为。目前临床上焦虑症的治疗药物主要有以下几种，选择性5-HT再摄取抑制剂（selectiveserotonin reuptake inhibitors, SSRIs），五羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂（serotonin norepinephrine reuptake inhibitors, SNRIs），苯二氮类（benzodiazepines，BDZs），单胺氧化酶抑制剂和-钙通道抗惊厥药等。由于这些药物明显的副作用，如起效慢、顺从性差、依赖性、以及可能的停药反应，研究人员正努力寻找新的治疗方法和分子靶点，其中最重要的一个方向就是神经肽类（neuropeptides）。涉及焦虑调节功能的神经肽类数目正不断增加，到目前为止，研究最广泛的有促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing factor, CRF）、P物质（substance P, SP）、血管升压素（vasopressin, VP）、神经肽Y（neuropeptide Y, NPY），其他类型如甘丙肽（galanin）、催产素（oxytocin）、胃动素（motilin），近年来也得到更多关注。 Motilin是一种主要由十二指肠粘膜内分泌细胞释放促进胃肠蠕动的脑肠肽，在胃肠道和中枢神经系统（central nervous system, CNS）中均有分布，motilin受体（MTLR）是一个G蛋白偶联受体，红霉素（erythromycin, EM）是其最先发现的非肽类激动剂。研究发现，除胃肠道外，MTLR也表达于杏仁核、海马和下丘脑等与焦虑和恐惧记忆相关的神经核团。目前认为，，杏仁核是神经系统情绪控制，尤其是焦虑和恐惧相关刺激调节的核心区域。更为重要的是，有报道显示脑室内注射胃动素具有明显的抗焦虑作用，但其机制仍不清楚。同时，杏仁核底内侧注射motilin剂量依赖地增加了清醒大鼠的胃收缩，而且，motilin受体大量表达在基底外侧杏仁核区（basolateral amygdala, BLA），所有这些提示motilin及其受体在杏仁核的表达不仅控制胃肠运动功能，可能在焦虑行为的调节中也具有重要作用。【研究目的】观察杏仁核BLA区motilin受体激活对不同因素引起的小鼠焦虑样行为的影响，考察杏仁核区motilin及其受体在不同神经元上的表达差异，研究motilin对不同类型神经元兴奋性及神经传递的作用，利用分子生物学、电生理学等手段揭示其可能的分子机制，为抗焦虑药的研发提供新靶点，为焦虑症的治疗提供新的思路和理论依据。【研究方法】 1.小鼠应激模型建立共建立了3种小鼠焦虑模型。1）小鼠置于自制水瓶中强迫游泳1或2次，每次30min，每天仅限一次，于不同时间点检测小鼠焦虑样行为，选择最佳参数为强迫游泳应激引起的小鼠焦虑模型；2）小鼠置于束缚器中1或2次，每次2h，每天仅限一次，于不同时间点检测小鼠焦虑样行为，选择最佳参数。 2.小鼠慢性炎性痛模型建立 10μl完全弗氏佐剂（CFA）小鼠足底注射，于不同时间点检测小鼠焦虑样行为，选择最佳参数。 3.小鼠焦虑相关行为学检测 1）高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）检测：小鼠头朝开臂放于装置中间平台区后，实验人员立即拉紧布帘，离开测试区，开始为期5min的检测，软件记录开、闭臂滞留时间和进臂次数。 2）旷场实验：高架十字迷宫结束后立即进行旷场实验。检测时，小鼠被放于盒子中央区，自由活动15min，检测小鼠在实验箱总活动路程和中央区活动时间。我们定义实验箱正中间的15×15cm2区域为中央区，占整个面积的四分之一。每个箱子每次只允许检测一只小鼠。 4. ELISA检测强迫游泳应激致焦虑小鼠和慢性炎性痛致焦虑小鼠杏仁核区motilin浓度的变化。 5. Western blot检测焦虑小鼠MTLR表达的变化，以及药物处理对其表达的影响。 6.杏仁核BLA区立体定位和微量注射 1）脑立体定位手术：套管定位于BLA区（bregma点后1.45mm，旁开3.5mm，下4.5mm）上部0.5mm后，立即用牙科水泥固定，待凝固后套管中插入套管帽。小鼠恢复一周后，开始行为学检测。 2）局部微量注射：小鼠单独放入小动物麻醉机麻醉后，插入注射内管（比套管长0.5mm），用微量注射泵以0.5μl/min的速度通过套管注射不同药物于双侧BLA区，每侧注射1min，后留针1min。注射完毕后，小鼠放回笼中，30min后接受强迫游泳应激处理。在慢性炎性痛实验中，注射完30min后，开始行为学检测。 7.免疫荧光双标法考察MTLR在杏仁核的表达，检测是否有细胞特异性分布。 8.电生理学检测MTLR激活对兴奋性和抑制性神经元兴奋性以及对兴奋性和抑制性神经传递的影响。【研究结果】 1.束缚应激1次，24h后小鼠产生焦虑样行为，且两次应激24h后更为明显；强迫游泳应激1次12h后小鼠产生焦虑样行为，24h后有所缓解，两次应激24h后则更为明显；CFA注射14d后小鼠产生焦虑样行为，且至少持续到28d后。 2.对MTLR表达检测结果显示，其表达水平随束缚应激次数的增加显著下降，强迫游泳应激两次24h后及CFA注射14d后，其表达也明显减少。ELISA检测显示，在相应时间点杏仁核motilin浓度也显著降低。由于束缚应激所用束缚器影响脑立体定位所留套管的稳定性，容易造成套管脱落，所以下面实验采用了强迫游泳应激模型和慢性炎性痛模型。 3.杏仁核BLA区局部注射后行为学检测结果显示，motilin和EM注射显著降低了强迫游泳应激和慢性炎性痛小鼠EPM中开臂滞留时间和旷场试验中央区滞留时间，而对闭臂进入次数和活动总距离没有影响，且MTLR选择性拮抗剂MA-2029能够逆转EM的这一作用。 4.免疫荧光结果显示，在杏仁核区MTLR与抑制性神经元特异性标记物谷氨酸脱羧酶67（glutamic acid decarboxylase67, GAD67）共定位，且MTLR免疫阳性神经元在BLA区明显多于侧核（lateral amygdala, LA）。 5.对神经元兴奋性检测结果显示，MTLR激活对BLA区锥体神经元动作电位发放频率以及静息膜电位（rest membrane potential, RMP）没有影响，但增加了中间神经元动作电位发放频率，且降低了其RMP，而MA-2029以及G蛋白抑制剂GDP-β-S阻断了MTLR激活对神经元兴奋性的影响。 6.对抑制性神经传递的影响检测结果显示，强迫游泳应激和慢性炎性痛均减弱了BLA区锥体神经元GABA能自发的抑制性突触后电流（spontaneous inhibitorypostsynaptic currents, sIPSCs）的幅度和频率， EM和motilin增加了正常和焦虑小鼠sIPSCs的幅度和频率，且这一作用被MA-2029所抑制。然而，MTLR激活对GABA能小的抑制性突出后电流没有影响（miniature inhibitory postsynapticcurrents, mIPSCs）。双脉冲易化结果显示，motilin显著减弱了双脉冲比率值（paired-pulse ratio, PPR），这一作用也能被MA-2029所阻断。 7.对兴奋性神经传递的影响检测结果显示，MTLR激活对自发的兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs）和小的兴奋性突出后电流（miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs）的幅度和频率都没有影响。 8.对小鼠痛觉影响的检测结果显示，CFA注射14d后，与盐水注射组相比，小鼠热刺痛和机械痛痛阈明显降低，但EM或motilin局部注射对热刺痛和机械痛痛阈均没有影响。【研究结论】本研究证实，MTLR选择性表达在杏仁核区抑制性中间神经元上；在束缚应激、强迫游泳应激以及慢性炎性痛导致的焦虑小鼠杏仁核区MTLR表达显著下降，motilin浓度也明显减少；而MTLR激动剂motilin和EM于杏仁核BLA区注射产生明显的抗焦虑作用；机制研究发现，MTLR激活选择性增加BLA区中间神经元兴奋性，增强GABA能神经传递，且这一作用是动作电位依赖的，但对锥体神经元兴奋性以及兴奋性神经传递没有影响。我们的研究为抗焦虑药的研发提供了一个新靶点，且首次揭示了motilin抗焦虑作用的电生理学基础，为基于motilin受体激动剂的抗焦虑药研究提供了理论依据。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R964

【参考文献】