OATP1B1 388GG和521CC基因多态表达平台建立及对他莫西芬的细胞摄取研究

发布时间：2018-08-05 19:50

【摘要】：目的：本研究旨在通过建立OATP1B1388GG和521CC基因多态表达平台,并运用此平台研究OATP1B1388GG;和521CC基因多态对他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)细胞摄取研究。 方法：运用分子生物学技术,构建pcDNA3.1(-)OATP1B1质粒,再运用定点突变技术的方法建立pcDNA3.1(-)-OATP1B1388GG和521CC质粒。在转染前,运用Real-time PCR,检测HEK293/MCF-7SLCO1B1的表达量。将建立完成的质粒分别转染HEK293/MCF-7细胞,通过Western-blot,检验OATP1B1蛋白表达；再通过PCR,验证各质粒转染情况。本次实验分为6组,分别为：A组为HEK293/MCF-7;B组为HEK293/MCF-7给予TAM;C组为HEK293/MCF-7转染pcDNA3.1(-)质粒给予TAM; D组为HEK293/MCF-7转染pcDNA3.1(-)OATP1B1质粒给予TAM; E组为HEK293/MCF-7转染pcDNA3.1(-)OATP1B1388GG质粒给予TAM; F组为HEK293/MCF-7转染pcDNA3.1(-)OATP1B1521CC质粒给予TAM。本次实验,运用pcDN A3.1(-)OATP1B1-HEK293基因多态性细胞表达平台,分别加入10μM、30μM和100μM TAM分别作用24h后和48h后,运用HPLC-MS/MS测定TAM在HEK293细胞内浓度。同时本次实验分别加入10μM TAM作用pcDNA3.1(-)OATP1B1-MCF-7分别在24h后和48h后,应用MTT和流式细胞仪检测细胞抑制率、细胞凋亡和细胞周期变化。 结果：1)给药24h后和48h后,各剂量组,B和C组细胞中TAM含量差异无统计学意义(P0.05)；B组细胞中TAM含量显著低于D、E和F组,差异有统计学(P0.05)；D组细胞中TAM含量略高于E和F组,各组之间比较差异无统计学意义(P0.05)。2)给药24h后和48h后,B和C组抑制率差异无统计学意义(P0.05)；B组抑制率显著低于D、E和F组,差异有统计学(P0.05)；D组抑制率略高于E和F组,各组之间比较差异无统计学意义(P0.05)。 3)给药24h后和48h后,B和C组细胞凋亡率差异无统计学意义(P0.05)；B组细胞凋亡率显著低于D、E和F组,差异有统计学(P0.05)；D组细胞凋亡率略高于E和F组,各组之间比较差异无统计学意义(P0.05)。 4)给药24h后和48h后,与A组相比,B、C、D、E和F组细胞周期阻滞于Go／G1期,S和G2M期细胞减少,差异有统计学(P0.05)；但是B和C组细胞周期之间差异无统计学意义(P0.05)；B组细胞周期与D、E和F组,Go／G1期减少,S和G2M期细胞增加,差异有统计学(P0.05)；D组Go／G1期略多于E和F组,S和G2M期略减少E和F组,各组之间比较差异差异无统计学意义(P0.05)。 结论：建立OATP1B1388GG和521CC基因多态表达平台,研究表明,OATP1B1388GG和521CC突变导致OATP1B1的摄取TAM能力降低,但与未突变基因组相比差异无统计学意义。
[Abstract]:Aim: to study the uptake of OATP1B1388GG and 521CC gene polymorphisms in Tamoxifentam cells by establishing a polymorphic expression platform for OATP1B1388GG and 521CC, and using this platform to study the uptake of OATP-1B1388GG and 521CC gene polymorphisms in Tamoxifentam cells. Methods: pcDNA3.1 (-) OATP1B1 plasmids were constructed by molecular biology technique, and pcDNA3.1 (-) -OACA1B1388GG and 521CC plasmids were constructed by site-directed mutagenesis. Before transfection, Real-time PCR was used to detect the expression of HEK293/MCF-7SLCO1B1. The constructed plasmids were transfected into HEK293/MCF-7 cells, and the expression of OATP1B1 protein was detected by Western-blot. The experiment was divided into six groups: group A: HEK293 / MCF-7B: HEK293/MCF-7: TAMM-C: HEK293/MCF-7 transfected with pcDNA3.1 (-) plasmid; group D: HEK293/MCF-7 transfected with pcDNA3.1 (-) OATP1B1 plasmid; group E: HEK293/MCF-7 transfected pcDNA3.1 (-) OATP1B1388GG plasmid; group F: HEK293/MCF-7 transfected pcDNA3.1 (-) OATP1B1521CC plasmid. In this experiment, the expression platform of pcDN A3.1 (-) OATP1B1-HEK293 gene polymorphism cells was used, 10 渭 M 30 渭 M and 100 渭 M TAM were added for 24 h and 48 h, respectively. The concentration of TAM in HEK293 cells was measured by HPLC-MS/MS. At the same time, pcDNA3.1 (-) OATP1B1-MCF-7 was treated with 10 渭 M TAM for 24 h and 48 h, respectively. The inhibition rate, apoptosis and cell cycle were detected by MTT and flow cytometry. Results there was no significant difference in TAM content between groups B and C after 24 and 48 hours (P0.05) the content of TAM in group B was significantly lower than that in group D and group F (P0.05). The content of TAM in group D was slightly higher than that in group E and F (P0.05). There was no significant difference between the two groups (P0.05). There was no significant difference in inhibition rate between group B and group C after 24 hours and 48 hours (P0.05). The inhibitory rate of group B was significantly lower than that of group D and group F (P0.05). The inhibitory rate of group D was slightly higher than that of group E and F (P0.05). There was no significant difference between the two groups (P0.05). 3) there was no significant difference in apoptosis rate between group B and group C after 24 hours and 48 hours (P0.05). The apoptosis rate of group B was significantly lower than that of group D E and group F (P0.05). The rate of apoptosis in group D was slightly higher than that in group E and F, and there was no significant difference between the groups (P0.05). After 24 hours and 48 hours of administration, the cell cycle of group D and group F was blocked in the Go/G1 phase, and the cells in S and G 2m phases were decreased. The difference was statistically significant (P0.05), but there was no significant difference between group B and group C (P0.05). The cell cycle in group B and group D, E and F decreased the increase of cells in S and G 2m phase (P0.05). The Go/G1 phase in group D was slightly lower than that in group E and F in S and G 2m, and there was no significant difference between the two groups (P0.05). Conclusion: the polymorphic expression platform of OATP1B1388GG and 521CC genes was established. The results showed that the mutation of OATP 1B1388GG and 521CC resulted in a decrease in the ability of OATP1B1 to uptake TAM, but there was no significant difference compared with the unmutated genome.
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

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本文编号：2166840