替卡西林钠及其制剂的质量控制方法与药物动力学研究

发布时间：2018-08-16 14:03

【摘要】：替卡西林是一种新的噻烯羧基青霉素,为半合成的抗假单胞菌青霉素,其抗菌谱和药理学特性与羧苄西林类似,通过干扰粘肽交叉联结而影响细菌细胞壁的合成,引起细胞壁的缺陷或薄弱,导致细菌畸形,继以迅速溶解死亡,从而达抗菌作用。替卡西林对革兰氏阳性菌的抑菌作用低于青霉素G;对革兰氏阴性菌的抑菌作用较羧苄西林强数倍。铜绿假单胞菌易对本品耐药。由于革兰阳性菌和阴性菌都能产生β-内酰胺酶,此类酶能在青霉素类药物作用于病原体之前发挥作用并将其破坏,从而降低其疗效。克拉维酸钾对多种β-内酰胺酶均是一种强有力的抑制剂,因此,它与替卡西林钠组成的复合剂型注射用替卡西林钠克拉维酸钾,抗菌活性更强,抗菌谱更广。该制剂是由葛兰素史克公司最早研制成功的,商品名为泰门汀。近年来,有文献报道该制剂对治疗老年社区获得性肺炎(CAP)有明显的疗效,而且非发酵菌(NFGNB)对其耐药性也低。目前,《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版中未收载该品种的原料药及制剂,现行标准均为企业由国家食品药品监督管理局批准的申报药品标准,而且各企业的质量标准在项目设置和限度规定上都存在一些问题,不能有效控制产品的质量。本研究首先建立了同时测定替卡西林钠及其制剂中主成分及有关物质含量的HPLC分析方法,该方法的应用可对替卡西林钠及其制剂中杂质的加以严格控制,对主成分的含量进行准确可靠地检测,充分提高了该药品的质量控制水平;建立了HPSEC法测定替卡西林钠及其制剂中高分子化合物的含量,该方法对严格控制β-内酰胺类抗生素中高分子化合物的含量有着重要的意义;还建立了同时测定样品中7种残留溶剂的GC分析方法,并采用GC-MS的分析方法对其它未知挥发性杂质进行结构鉴定及含量测定;比较了不同替卡西林钠原料药来源(即不同R、S比例的替卡西林)的替卡西林制剂在抗菌活性和急性毒性方面的差异;本研究还建立了灵敏度高,专属性强,分析速度快的UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠血浆样品中的主成分的含量,并将该方法应用于大鼠静脉注射给药后的药物动力学研究,为注射用替卡西林钠克拉维酸钾的临床应用提供了新的参考依据。第一部分HPLC法同时测定替卡西林钠及其制剂中的主成分及有关物质的含量目的:建立同时测定替卡西林钠及注射用替卡西林钠克拉维酸钾中主成分及有关物质的HPLC方法。对2家生产企业的6批替卡西林钠和4家生产企业的12批注射用替卡西林钠克拉维酸钾中主成分及有关物质的含量进行测定;对8家生产企业共37批次抽验样品注射用替卡西林钠克拉维酸钾制剂的质量进行考察,并对其检测结果进行分析和评价。方法:采用Waters XBridge~(TM) C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱;有关物质检查以0.01 mol/L磷酸氢二铵溶液(p H 7.0)为流动相A,0.01 mol/L磷酸氢二铵溶液(p H 7.0)-甲醇(50:50)为流动相B,梯度洗脱;含量测定以0.01 mol/L磷酸氢二铵溶液(用磷酸调节p H值至7.0)-甲醇(80:20)为流动相,等度洗脱;流速为1.0 m L/min;检测波长为220nm;柱温为30℃。结果:有关物质检查中的梯度洗脱法具有更强的分析杂质的能力,样品中各成分的分离度及检测灵敏度均满足有关物质测定要求。替卡西林杂质A及破坏条件下产生的降解杂质峰与主成分峰分离较好;替卡西林在19.52~1561.76μg/m L浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.9999);克拉维酸在1.22~121.79μg/m L浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.9998);替卡西林与克拉维酸的平均加样回收率均为99.8%,相对标准偏差(RSD)分别为0.4%、0.7%(n=9)。替卡西林的检测限(LOD)为0.24μg/m L,克拉维酸的检测限(LOD)为0.19μg/m L;替卡西林杂质A、其它最大杂质和总杂质含量的重复性的RSD均小于1.0%;替卡西林和克拉维酸的日内、日间精密度的RSD均小于1.1%;供试品溶液于12 h内低温条件下比较稳定,但在室温条件下稳定性差。原料药与制剂样品中替卡西林杂质A的含量均小于1.5%,最大单一杂质的含量均小于2.0%,总杂质的含量均小于4.0%。替卡西林和克拉维酸的含量按无水物计算,替卡西林含量测定结果分布于79.7%~85.4%之间,克拉维酸含量测定结果分布于5.1%~5.8%。结论:本研究建立了HPLC法测定替卡西林钠及其注射用替卡西林钠克拉维酸钾中主成分及有关物质的含量,该方法灵敏度高、专属性强、重现性好,可用于替卡西林钠及其制剂的质量控制。第二部分HPSEC法分离测定替卡西林钠及其制剂中的高分子化合物目的:建立高效分子排阻色谱(HPSEC)法测定替卡西林钠及其制剂中的高分子化合物的分离分析方法。应用该法对2家生产企业的6批替卡西林钠原料药和4家生产企业的12批注射用替卡西林钠克拉维酸钾中的高分子化合物进行测定。对8家生产企业37批次抽验样品注射用替卡西林钠克拉维酸钾制剂的质量进行评价,并其结果进行统计学分析。方法:采用TSKGEL G2500PWXL凝胶色谱柱(300 mm×7.8 mm,5μm);流动相为p H7.0的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液[取0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)];流速为0.6 m L/min;检测波长为230 nm;柱温为室温。通过化学反应方法对高分子化合物进行验证,采用柱切换技术将凝胶色谱峰在反相色谱系统中进行定位,并与Sephadex G-10凝胶色谱柱所测定的高分子化合物进行定性比较,来判定方法的可行性。结果:替卡西林与其高分子化合物的色谱峰可达到基线分离(分离度为2.27),高分子化合物峰的理论板数为6000左右且对称性良好(对称性为0.90),分析时间短,20 min内即可完成。替卡西林浓度在0.50~40.16μg/m L范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999,n=7);LOQ为3.60μg/m L,LOD为1.15μg/m L;日内、日间精密度的RSD均小于3.5%。通过化学反应方法、柱切换技术验证并确定了该杂质,与Sephadex G-10凝胶色谱柱所测定高分子化合物的方法相比,本研究所使用的TSKGEL G2500PWXL凝胶色谱柱可实现更高的柱效和更快的分析速度。结论:本研究建立了使用TSKGEL G2500PWXL凝胶色谱柱对替卡西林钠及其制剂中的高分子化合物进行检测。该方法操作简单,专属性强,灵敏度高,可以用于β-内酰胺类抗生素中高分子化合物的控制,对减少该类药品的在临床上的过敏反应具有十分重要的意义。第三部分采用GC和GC-MS法同时测定替卡西林钠及其制剂中的挥发性杂质目的:建立顶空气相色谱法同时测定替卡西林钠及其制剂中的甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯等7种残留溶剂的含量,并采用气相色谱-质谱联用技术,结合质谱数据检索对样品中的未知挥发性杂质进行结构鉴定及含量测定。方法:GC条件:色谱柱为DB-624毛细管柱(30 m×0.25 mm,1.40μm);柱温采用程序升温:40℃保持5 min,以10℃/min的速率升至200℃,保持4 min;氢火焰离子化检测器(FID),检测器温度250℃;分流进样,分流比:10:1;进样口温度:200℃;载气:氮气,流速:5.0 m L/min;顶空进样,平衡温度:85℃,平衡时间:30 min。GC-MS条件:色谱条件:除载气为氦气(He)、流速为1.0 m L/min外,其余条件同GC条件。质谱条件:离子源温度:230℃;传输线温度:250℃;接口温度:230℃;溶剂切割时间:4 min;四极杆温度150℃;采用电子轰击离子化(EI源);电离方式:电子能量70 e V;扫描方式:Full scan;扫描范围:m/z 30~500;检测时间:3.00~25.00 min。结果:7种残留溶剂之间的分离度良好,理论板数分别以其待测成分的色谱峰计算均不低于5000;甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯的线性范围分别为1.53~610.24μg/m L、2.55~1020.76μg/m L、2.55~1020.96μg/m L、2.56~1014.96μg/m L、2.53~1013.24μg/m L、0.86~342.72μg/m L、2.57~1026.76μg/m L(r2≥0.9983);平均回收率为89.2%~105.4%,RSD在2.2%~4.5%之间;LOQ≤2.57μg/m L;精密度的RSD≤2.3%;供试品溶液在12 h内稳定性良好。2家生产企业的6批原料药与4家生产企业的12批制剂中7种有机溶剂的残留量均符合《中国药典》2015年版中对残留溶剂限量的相关规定。生产企业C与生产企业F、生产企业D与生产企业E的替卡西林钠原料药分别来源于同一家生产企业且生产工艺相同。通过对样品中未知挥发性杂质的检测结果分析,生产企业C与生产企业F的样品中含有乙酸丁酯,生产企业D与生产企业E的样品中含有正丁醇、乙酸丁酯、二氯甲烷和2-乙基己酸。结论:本研究建立了GC法同时测定替卡西林钠及其制剂中7种残留溶剂的含量,并采用GC-MS法对样品中未知挥发性杂质的结构进行鉴定及含量测定。该方法操作简便,准确度高,重现性好,在所考察的浓度范围内各组分线性关系良好,各色谱峰之间的分离度均符合要求。该方法为替卡西林钠及其制剂的质量控制提供了重要依据。第四部分两种原料来源的替卡西林制剂的抗菌活性及其急性毒性试验比较目的:建立抗生素微生物检定法中的浊度法测定替卡西林的抗菌活性,并考察两家不同原料来源的生产企业(替卡西林R、S异构体比例不同)的样品中替卡西林抗菌活性的高低。通过对小鼠进行急性毒性试验研究,比较两家不同原料来源的生产企业的样品间LD50范围的差异。方法:取金黄色葡萄球菌为实验菌悬液,浓度为2%~3%;一剂量法是用p H 6.0磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 mg/L的标准溶液,供试品溶液浓度为0.4 mg/L,绘制标准曲线,根据标准曲线计算供试品的效价;或选择0.3 mg/L和0.6 mg/L为二剂量法测定浓度,计算供试品的效价。分别采用一剂量和二剂量法对替卡西林及其制剂中替卡西林的抗菌活性进行测定,并比较两种不同替卡西林R、S比例的注射用替卡西林钠克拉维酸钾的抗菌活性的高低。根据个体动物的体质量,依照0.4m L/10 g的注射体积/体质量比,小鼠接受的注射液剂量为4 g/kg体重,每只小鼠注射0.5 m L。对照组动物注射相同体积比的生理盐水。注射速度约为0.2 m L/90 s,单只动物的注射时间约为3 min。观察72 h内小鼠的生长及死亡情况,并用Bliss法计算半数致死量(LD50),比较两种不同替卡西林R、S比例的注射用替卡西林钠克拉维酸钾的急性毒性的大小。结果:替卡西林浓度在0.1~1.6 mg/L范围内,吸光度值A与抗生素浓度的对数成良好的线性关系,相关系数r2=0.9996;平均回收率为98.1%,RSD为1.3%;日内、日间精密度的RSD分别为0.7%、1.1%。由替卡西林原料药及制剂的效价测定结果显示,生产企业C中替卡西林的效价值略高于生产企业D。依不同给药剂量经小鼠尾静脉注射注射用替卡西林钠克拉维酸钾后,与溶剂对照组动物相比,样品处理组动物会不同程度的出现异常反应、体质量下降和死亡的情况。LD50范围分别为:生产企业C为4.62~5.72 g/kg体重,生产企业D为3.42~4.30 g/kg体重。结论:该方法不仅适用于对替卡西林原料药抗菌活性的考察和急性毒性的研究,还可以对来自不同生产企业、含有不同替卡西林R、S比例的注射用替卡西林钠克拉维酸钾的抗菌活性和急性毒性进行比较,为临床安全用药提供了参考依据。第五部分UPLC-ESI-MS/MS法测定大鼠静脉注射替卡西林制剂后血浆中的主成分及药物动力学研究目的:建立一种同时测定大鼠血浆中替卡西林和克拉维酸该2种主成分含量的UPLC-ESI-MS/MS方法,成功的应用于大鼠静脉注射给予注射用替卡西林钠克拉维酸钾后血浆中替卡西林R、S异构体和克拉维酸的药物动力学研究,并建立其药-时曲线,阐明药动学参数与特征。方法:大鼠静脉注射给予注射用替卡西林钠克拉维酸钾(500 mg/kg)后,分别于给药后0.08,0.25,0.5,0.75,1,2,4,6,9,12,18,24和48 h眼内眦静脉丛取血,制备血浆样品,采用乙腈直接沉淀蛋白法进行样品预处理,甲苯磺丁脲为内标。色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7mm);柱温为30℃;流动相为A(0.1%甲酸水溶液,v/v)-B(0.1%甲酸乙腈溶液,v/v),采用梯度洗脱方式,梯度洗脱程序如下:0.0-1.00 min,80%-10%A;1.00-1.20 min,10%A等度洗脱;1.20-1.21min,10%-80%A;1.21-1.50 min,80%A等度洗脱。每次进样前预平衡1 min。流速为0.6 m L/min。色谱柱后溶液无分流,全部进入离子源,总体分析时间3 min,进样量2μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),Step Wave?离子源,离子源温度(Source Temp)为150℃,毛细管(Capillary)电压为2.0 k V,离子源补偿电压(Source Offset)为50 V,脱溶剂气温度(Desolvation Temp)为500℃,脱溶剂气(Desolvation)流量为800 L/Hr,锥孔气(Cone)流量为150 L/Hr,雾化气(Nebuliser)压力我7.0 Bar,接口处加热,采用多反应监测模式(MRM)。待测化合物和内标物的监测离子对分别为:替卡西林R(m/z 385.2/160.2)、替卡西林S(m/z385.2/204.2)、克拉维酸m/z 197.9/136.0和甲苯磺丁脲m/z 271.1/91.1。结果:血浆中替卡西林R(m/z 385.2/160.2)在30-10000 ng/m L范围内,线性关系良好(r2=0.9967),替卡西林S(m/z 385.2/204.2)在10~10000 ng/m L范围内,线性关系良好(r2=0.9961),克拉维酸在30~10000 ng/m L范围内,线性关系良好(r2=0.9981),最低定量限(LLOQ)≤10.0 ng/m L。日内、日间精密度的RSD均小于4.3%,相对误差(RE)为-4.7%~5.0%。平均提取回收率为86.9%~96.4%。大鼠静脉注射注射用替卡西林钠克拉维酸钾后,血浆中替卡西林两差向异构体和克拉维酸等待测成分在大鼠体内的药物动力学药-时曲线有所差异。总体来说,大鼠静脉注射注射用替卡西林钠克拉维酸钾后,替卡西林两差向异构体和克拉维酸在体内吸收均较迅速,替卡西林(m/z 385.2/204.2)和克拉维酸具有相近的消除速率。替卡西林(m/z 385.2/160.2)的消除速率较慢。结论:本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠血浆中替卡西林和克拉维酸的含量,并应用于替卡西林制剂中2种主成分在大鼠体内的药物动力学研究。该方法操作简单快速、专属性强、灵敏度高,对该制剂的体内定量分析具有重要意义,且有益于其临床应用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R927.2;R96

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