重组rSPA免疫吸附剂的合成过程优化和性能评价

发布时间：2018-09-08 07:47

【摘要】：研究背景 天然金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphy lococcal protein A, SPA,蛋白A)是一种存在于大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的单肽链蛋白质[1]。SPA的氨基末端有5个高度同源的Fc结合区,可与人类及其他哺乳动物的免疫球蛋白IgG的Fcγ段结合[2],SPA的羧基末端则可交联各种支架结构,如与琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶等共价偶合,以此来制备rSPA亲和填料[3]。SPA与免疫球蛋白的结合是可逆的,在生理pH下两者可紧密结合,当pH值降低至2.3-2.5时,SPA可被解离洗脱,而当恢复到生理pH后,SPA又可恢复结合免疫球蛋白的能力,这种特性使SPA免疫吸附剂可以重复使用。蛋白A免疫吸附剂是免疫吸附(immunoadsorption, IA)治疗中应用最广泛的吸附剂,它以SPA为配基,与固相载体结合制成吸附柱,通过选择性地清除血中致病抗体,从而达到净化血液,缓解病情的目的。目前,国外利用基因工程技术生产重组rSPA (recombinant staphy lococcal protein A, rSPA),实现了SPA的工业化生产,Immunosorba和Prosorba是最常用的两种蛋白A吸附柱,二者均获得了美国食品和药物管理委员会(FDA)的认证,用于治疗特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及带有抑制因子的血友病等[4-6]。在国内,由于原材料蛋白A的纯化技术和蛋白A免疫吸附剂的合成工艺落后,国产蛋白A免疫吸附剂并未得到工业化生产,而进口蛋白A免疫吸附剂因为价格昂贵而极大地限制了临床应用。目前,国际上最常用的蛋白A免疫吸附材料,采用溴化氰和羰基咪唑作为活化剂,这些方法都具有一定的缺陷。为此,本文利用前期在实验室纯化的重组蛋白A的基础上,尝试寻找一种适用于制备医用蛋白A免疫吸附剂的合成路径。本研究以琼脂凝胶Sepharose-6FF为载体,分别采用环氧氯丙烷(ECH)和高碘酸钠(NaIO4)作为活化剂,优化其反应条件后,从活化基团密度、rSPA偶联量和对IgG的吸附量等方面比较优化效果,对于合成的免疫吸附剂,通过其对人血浆中不同类型抗体成分的吸附和重复使用性评价使用效果,并且通过检测其配基rSPA的脱落量等方面来进行安全性评价。我们的目的是探寻一种能生产出低成本、安全、高效的蛋白A吸附剂的合成方法,该研究为蛋白A免疫吸附剂的工业化生产和广泛的临床运用奠定了基础。 研究方法 1.ECH活化琼脂糖凝胶 1.1NaOH浓度对环氧基活化密度的影响 取一定体积的琼脂糖凝胶Sepharose-6FF,置于玻璃漏斗中,并用大量反渗水冲洗,并真空抽干3min,称取7份样品,每份5g,分别置于50mL的锥形瓶中。每瓶加入5ml ECH和5ml NaOH溶液(浓度分别为1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4mol/l)。封口后放入摇床(40℃,180rpm)[7],反应2h后,用大量反渗水冲洗至清洗液中无环氧基残留,真空抽干3min后,留取活化的琼脂糖凝胶并测定其环氧基的密度。 1.2ECH用量对环氧基活化密度的影响 取一定体积的琼脂糖凝胶Sepharose-6FF,洗净并抽干如1.1,称取5份,每份5g,分别置于50mL的锥形瓶中。加入5ml一定浓度的NaOH,再加入ECH,浓度分别为(10%、20%、30%、40%和50%(v/v)),封口后放入摇床(40℃,180rpm)反应2h,用大量反渗水冲洗至清洗液无环氧基残留,真空抽干3min后,留取活化的琼脂糖凝胶并测定其环氧基的密度。 1.3反应时间对环氧基活化密度的影响 取一定体积的琼脂糖凝胶Sepharose-6FF,洗净并真空抽干如1.1,称取4份,每份5g,分别置于50mL的锥形瓶中。加入5ml ECH和5ml一定浓度的NaOH溶液,封口后放入摇床分别反应1h、2h、3h和4h后,用大量反渗水冲洗至清洗液无环氧基残留,真空抽干3mmin,留取活化的琼脂糖凝胶并测定其环氧基的密度。 1.4反应温度对环氧基活化密度的影响 取一定体积的琼脂糖凝胶,冲洗并真空抽干如1.1,称取4份,每份5g,分别置于50mL的锥形瓶中。加入5ml ECH和5ml一定浓度的NaOH溶液,封口后分别于20℃、30℃、40℃、50℃条件下反应2h,冲净至清洗液无环氧基残留,真空抽干3min后,留取活化的琼脂糖凝胶并测定其环氧基的密度。 2.NaIO4活化琼脂糖凝胶 2.1NaIO4加入量的影响 取一定体积的琼脂糖凝胶Sepharose-6FF,冲洗并真空抽干如1.1,称取5份,每份5g,分别置于50mL的锥形瓶中。加入5m1NaIO4,浓度为(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/1),封口后放入摇床反应(37℃,180rpm),反应4h,再用反渗水冲洗至清洗液用碘化钾试纸检验显示为无色,真空抽干3min,留取活化的琼脂糖凝胶并测定醛基密度。 2.2反应温度的影响 取一定体积的琼脂糖凝胶Sepharose-6FF,冲洗并真空抽干如1.1,称取5份,每份5g,分别装入50mL的锥形瓶中。加入0.1mmol/1的NaIO4溶液,封口后放入摇床分别在25℃,35℃和40℃条件下,180rpm,反应4h后,再用反渗水冲洗至清洗液用碘化钾试纸检验显示为无色,真空抽干3min,留取活化的琼脂糖凝胶并测定醛基密度。 2.3反应时间的影响 取洗净并抽干的Sepharose-6FF5份,每份5g,分别装入50mL的锥形瓶中,加入0.1mol/1的NaIO4溶液,封口后放入摇床(37℃,180rpm),分别反应1h、2h、3h和4h,再用反渗水冲洗,至清洗液用碘化钾试纸检验显示为无色,真空抽干3min,留取活化的琼脂糖凝胶并测定其醛基密度。 3. rSPA的用量对免疫吸附剂的rSPA偶联量的影响 3.1rSPA的用量对ECH活化的Sepharose-6FF的蛋白质A偶联量的影响 取ECH活化所得的琼脂糖凝胶分成6份,每份10g,连接己二胺和戊二醛之后,各加入不同量的rSPA (1、2、3、4、5和6mg/g gel),在37℃,180rpm条件下反应24h后,抽干反应溶液,加100ml反渗水冲洗凝胶,留取清洗液,测量体积。再反复冲洗后,抽干凝胶,用乙醇胺溶液作为封端剂,最后用5%硼氢化钠溶液作为还原剂。用BCA试剂盒测定清洗液中的rSPA的浓度,用差量法计算rSPA的偶联量,方法按照试剂盒说明。 3.2rSPA的用量对NaIO4活化的Sepharose-6FF的rSPA偶联量的影响 取NaIO4活化所得的琼脂糖凝胶分成6份,每份10g,加入不同量的rSPA(1、2、3、4、5和6mg/g gel),在37℃,180rpm下反应24h后,抽干反应溶液,加100ml反渗水冲洗凝胶,留取清洗液,测量体积。再反复冲洗后,抽干凝胶,用5%硼氢化钠溶液作为还原剂。用BCA试剂盒测定清洗液中的rSPA的浓度,用差量法计算rSPA的偶联量,方法按照试剂盒说明。 3.3用未活化的Sepharose-6FF作为空白对照吸附剂,处理方法如3.2 4. rSPA的用量对吸附剂的IgG吸附量的影响 (1)选取合适的玻璃层析柱(d=1cm, V=10ml),将其与配套恒流泵和核酸蛋白质检测仪的色谱系统组联,检测波长为280nm。 (2)取ECH法所制备的吸附剂和NaIO4法所制备吸附剂(从3中获得)两种rSPA吸附剂,用大量的反渗水冲洗,并真空抽干后,准确称取2.8g(沉降体积4.2ml) rSPA免疫吸附剂装入柱内。 (3)用平衡液10mL、20mL洗脱液和30mL平衡液依次冲洗柱子(流速5.0ml/min),至核酸蛋白质检测仪所测基线平稳。 (4)取20ml血浆,加入柱内(流速为2.5ml/min),血浆通过吸附柱后,收集穿流吸附柱的血浆,测量其体积。再加入平衡液40ml冲洗柱体(流速为5ml/min),至核酸蛋白质检测仪所测基线平稳后,加入洗脱液(流速为5ml/min),观察核酸蛋白质检测仪数值变化,在洗脱峰处收集洗脱液,并测量洗脱液的体积,将收集的洗脱液pH值调节至7,采用免疫比浊法测量洗脱液中IgG的含量,比较两种吸附剂的对IgG吸附能力。 5. rSPA免疫吸附剂对血浆中各组分的吸附量的比较 (1)取ECH所制备的吸附剂(rSPA用量为6mg/g gel)、NaI04所制备吸附剂(rSPA用量为6mg/g gel)和未活化的Sepharose-6FF三种填料,冲洗并抽干后的各称取2.8g,进行血浆吸附实验,处理方法同4。 (2)收集穿流吸附柱的血浆样品,测量穿流吸附柱的血浆的体积。采用免疫比浊法测量血浆原液和穿流血浆中白蛋白、IgG、IgM、IgA、纤维蛋白原、甘油三脂、胆固醇、脂蛋白(高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)等血浆蛋白质的浓度,用差值法计算吸附量。 6.两种rSPA吸附剂的重复使用性检测 (1)取两种rSPA免疫吸附剂(rSPA用量为6mg/g gel),冲洗并真空抽干后,各称取2.8g,进行血浆吸附实验,处理方法同4。 (2)每次实验结束后,用平衡液10mL,20mL洗脱液和30mL平衡液依次冲洗柱子(流速5ml/min),使吸附剂的吸附能力再生,然后重复实验(方法同4),共10次,收集每次实验所得洗脱液,测量洗脱液的体积,并采用免疫比浊法测量洗脱液中IgG的含量,计算两种吸附剂对IgG的吸附量,以此评估吸附剂的重复使用性。 7.蛋白A吸附剂的rSPA脱落量的检测 (1)分别取ECH所制备的吸附剂(rSPA用量为6mg/g gel)、NaIO4所制备吸附剂(rSPA用量为6mg/g gel)各75ml,装入合适的玻璃层析柱内。 (2) rSPA免疫吸附柱接入血管通路和恒流泵。 (3)先用3L生理盐水冲洗填料和管路,然后用1L生理盐水冲洗填料。然后收集这1L生理盐水冲洗液,测定该冲洗液中的rSPA的含量。 8.统计学方法 所有数据均代表三次重复实验的结果,以均数±标准差表示。方差齐的样本均数的比较采用one-way ANOVA,多组均数组间的比较采用LSD法,重复测量的数据用repeated measures ANOVA方差分析,所有统计分析由软件SPSS17.0完成,P0.05为有显著差异。 结果 1.ECH法活化琼脂糖凝胶条件的优化 1.1NaOH浓度的影响 6份琼脂糖凝胶样品,在不同浓度的NaOH溶液(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mol/l)条件下活化。结果显示：琼脂糖凝胶的环氧基活化密度有显著差异(方差齐,采用one-way ANOVA,F=278.466,P=0.00)。NaOH溶液浓度值从1增加到3.5mol/1时,随着NaOH浓度的增加,琼脂糖凝胶的活化密度逐渐增大,依次为33.53±0.10、37.32±0.87、39.43±0.56、44.34±0.62、45.91±078和49.51±0.75, NaOH浓度为3.5mol/l时,活化基团的密度达到最大,NaOH浓度为4.0mol/l时,环氧基活化密度相比NaOH浓度为3.5mol/l无显著差异(49.11±0.45,P=0.450.05)。 1.2ECH用量的影响 5份琼脂糖凝胶Sepharose-6FF样品,在不同浓度(10%、20%、30%、40%和50%)的ECH条件下反应,环氧基的活化密度有显著差异(方差齐,采用one-way ANOVA,F=400.13,P=0.00)。浓度从10%增加到30%时,随着ECH浓度增大,活化密度逐渐增高,依次为10%ECH,4.37±0.45;20%ECH,28.87±0.47;30%ECH,42.82±1.80。浓度为30%时,活化密度最高,当浓度超过30%时,继续增加ECH的浓度,活化密度不再增加,40%ECH组(41.71±1.98)和50%ECH组(41.78±1.59)的活化密度与30%ECH组相比,无显著差异(40%ECH, P=0.360.05;50%ECH, P=0.390.05);40%ECH组和50%ECH组相比,无显著差异(P=0.9530.05)。 1.3反应时间的影响 4份琼脂糖凝胶Sepharose-6FF,分别反应1h、2h、3h和4h后,结果显示：琼脂糖凝胶的环氧基活化密度有显著差异(方差齐,采用one-way ANOVA,F=113.123,P=0.00)。反应时间为2h时,琼脂糖凝胶的活化密度最大(41.78+0.23)；反应时间为1h和3h次之(40.02±0.25,40.29±0.08),两者无显著性差异(P=0.2070.05)；4h时最低(38.17±0.34)。 1.4反应温度的影响 4份琼脂糖凝胶样品,在不同温度条件下反应(20℃、30℃、40℃、50℃)。结果显示：琼脂糖凝胶的环氧基活化密度有显著差异(方差齐,采用one-way ANOVA,F=337.817,P=0.00)。40℃时琼脂糖凝胶Sepharose-6FF的活化密度最高(45.21±0.79),30℃次之(39.96±0.17),20℃处理组为(33.99±0.40),50℃处理组最低(27.66±1.11)。 2. NaIO4活化琼脂糖凝胶条件的优化 2.1NaIO4溶液浓度的影响 5份琼脂糖凝胶样品,在NaIO4溶液浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/I的条件下反应,结果显示：各组样品中醛基的活化密度有显著差异(方差齐,采用one-way ANOVA, F=2100.896, P=0.00)。 NaIO4的浓度从0.05增加到0.1mol/l时,琼脂糖凝胶中醛基的活化密度随着浓度增大而增加(0.05mol/l组,57.32±0.60；O.1mol/l组,109.42±0.85)。0.1mol/l时,醛基的活化密度最大,0.2mol/l时,相比0.1mol/l组醛基的活化密度降低,而从0.2到0.5mol/l之间,琼脂糖凝胶中醛基的活化密度逐渐降低(0.2mol/l组,99.92±0.90；0.3mol/l组,95.25±0.24;0.4mol/l组,93.55±0.28；0.5mol/1组,91.88±0.82)。 2.2反应温度的影响 5份琼脂糖凝胶样品,分别在30℃、35℃和40℃的条件下反应,结果显示：样品中醛基的含量有显著性差异(方差齐,采用one-way ANOVA,F=134.14,P=0.00)。35℃时,醛基的活化密度最高(106.24±1.11),30℃次之(92.03±1.50),40℃时最低(85.41±2.02)。 2.3反应时间的影响 5份琼脂糖凝胶样品,反应时间分别为Ih、2h、3h、4h和5h。结果显示：样品中醛基的含量有显著性差异(方差齐,采用one-way ANOVA,F=2206.16,P=0.00),反应时间在1h到4h之间,醛基的活化密度随着时间的延长而增加,依次为38.32±0.36,77.82±0.12,96.09±0.19和107.59±1.37。5h组与4h组的醛基的活化密度相比无显著差异(5h,101.70±1.84,P=0.902)。 3.rSPA的用量对活化琼脂的rSPA偶联量和对免疫吸附剂的IgG的吸附量的影响 3.1rSPA的用量对活化琼脂的rSPA偶联量的影响 在不同rSPA用量条件下(1、2、3、4、5和6mg/g gel),未活化的琼脂糖凝胶和rSPA不发生偶联,偶联前后rSPA的量无变化,比较ECH法和NaIO4法活化的琼脂糖凝胶的rSPA偶联量(方差齐,one-way ANOVA)。rSPA加入量为1mg/g gel时,ECH组(0.87±0.01)与NaIO4组(0.86±0.12)相比无显著性差异(F=1.471,P=0.292); rSPA加入量为2mg/g gel时,ECH组(1.77±0.02)明显大于NaIO4组(1.27±0.05)(F=288.80,p=0.00); rSPA加入量为3mg/g gel时,ECH组(2.82±0.05)明显大于NaIO4组(1.80±0.02)(F=1224.01,p=0.00);rSPA加入量为4mg/g gel时,ECH组(3.93±0.04)明显大于NaIO4组(2.25±0.03)(F=3577.69, p=0.00); rSPA加入量为5mg/g gel时,ECH组(4.91±0.35)明显大于NaIO4组(2.77±0.51)(F=3572.88, p=0.00); rSPA加入量为6mg/g gel时,ECH组(5.90±0.46)明显大于NaI04组(3.31±0.17)(F=9384.50,p=0.00)。 3.2rSPA的用量对两种免疫吸附剂的IgG的吸附量的影响 在不同rSPA用量条件下(1、2、3、4、5和6mg/g gel),两种吸附剂对IgG的偶联量有显著差异(方差齐,one-way ANOVA方法)：rSPA加入量为1mg/g gel时,ECH组(8.52±0.03)明显小于NaIO4组(10.54±0.11)(F=881.46,P=0.00);rSPA加入量为2mg/g gel时,ECH组(10.80±0.03)明显小于NaIO4组(12.67±0.04)(F=3869.41,p=0.00); rSPA加入量为3mg/g gel时,ECH组(15.37±0.05)明显小于NaIO4组(18.87±0.09)(F=3744.41, p=0.00); rSPA加入量为4mg/g gel时,ECH组(19.00±±0.10)明显小于NaIO4组(20.29±±0.76)(F=336.04, p=0.00); rSPA加入量为5mg/g gel时,ECH组(22.19±±0.28)明显小于NaIO4组(23.01±0.21)(F=17.07, p=0.01); rSPA加入量为6mg/g gel时,ECH组(23.73±±0.10)明显小于NalO4组(24.49±±0.03)(F=173.86,p=0.00)。 4.不同的吸附剂对血浆蛋白的吸附量的比较 三种不同的吸附剂对血浆成分的吸附量有显著差异(方差齐,one-way ANOVA, F=15313.06, P=0.00),其中用NaIO4法活化的吸附剂的IgG吸附量最大(21.49±±0.10)；ECH组次之为(20.04±0.08)；未活化琼脂对IgG吸附量最低(3.54±0.03)。NaIO4制备吸附剂对IgM的吸附量(0.38±0.02)明显大于ECH组(0.32±0.02)(方差齐,采用one-way ANOVA, F=13.50, P=0.020.05); NaIO4制备的吸附剂对IgA的吸附量(1.60±0.04)明显大于NaIO4组(1.43±0.02)(方差齐,采用one-way ANOVA, F=11.95, P=0.030.05)。三种不同的吸附剂对非抗体成分白蛋白吸附量有显著差异(方差齐,采用one-way ANOVA分析,F=229976.23, P=0.00), NaIO4组(18.53±±0.02,P=0.00)和ECH组(18.49±0.02,P=0.00)与未活化的琼脂糖凝胶组(2.13±±0.03)相比均有显著差异,但NaIO4组与ECH组之间相比无显著差异(P=0.2010.05)。三者均对纤维蛋白原、甘油三脂、胆固醇、脂蛋白(高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)等成份的吸附力较弱。 5.ECH法和NaIO4法合成的两种rSPA吸附剂的重复使用性的评估 重复使用10次后,ECH法和NaIO4法合成的两种rSPA吸附剂对IgG的吸附能力没有明显的改变。实验数据经Mauchly's Test of Sphericity检验(P=0.00),表明重复测量的数据之间具有很强的相关性,需要用repeated measures-ANOVA方差分析,结果显示：使用10次所得的IgG吸附量之间无显著差异(F=0.933,P=0.590.05)；不同的吸附剂对IgG的吸附量有明显的差异(F=182.73,P=0.00),重复使用和不同吸附剂这两个因素的交互作用也对IgG的吸附量无显著影响(F=1.041,P=0.4270.05)；重复使用10次后,两种吸附剂对IgG的吸附量没有明显的改变,始终维持在20mg/ml gel以上。 6.两种rSPA吸附剂的rSPA脱落量的检测 ECH法合成的免疫吸附剂的SPA的脱落量(3.42±0.12)明显小于NaIO4法(0.657±0.07)(方差齐,采用one-way ANOVA,F=1121.408,P=0.00)。 结论 1.ECH活化法的最佳条件分别是30%ECH、3.5mol/1NaOH、40℃和反应2h。在最优条件下,环氧基活化密度可达到65umol/ml左右。 2.NaIO4活化法的最佳条件分别是NaI04浓度为0.1mol/1、35℃、反应4h。在最优条件下,醛基的活化密度可达到120umol/ml左右。 3.在相同rSPA用量下,ECH活化的sepharose-6FF对SPA的偶联量高于NaIO4活化的sepharose-6FF,但是NaI04活化法制备的吸附剂比ECH法对IgG的吸附量大。ECH活化法所制的吸附剂对IgG的吸附量可达到24mg/ml左右,NaIO4活化法所制的吸附剂可达到26mg/ml左右。 4.ECH法和NaI04法合成的两种吸附剂对血浆中的抗体成分IgG、IgM和IgA都有明显的吸附能力,并且NaI04法制备的吸附剂大于ECH法制备的吸附剂。两者对白蛋白也有明显的吸附能力,但是相互之间无差别。而对纤维蛋白原、甘油三脂、胆固醇、脂蛋白(高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)等非抗体成分的吸附力较差。 5.重复使用10次后,ECH法和NaIO4法合成的两种吸附剂对IgG的吸附量都没有明显的改变,始终维持在20mg/ml gel以上。 6.ECH法合成的免疫吸附剂的rSPA的脱落量明显小于NaIO4法。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R914.5

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 郭贤权,吴向东,徐家毅,赵芬芝,陈友安,何炳林,杨彦,任建卫;吸附型“人工肝”辅助材料的制备及其性能研究Ⅱ.免疫吸附剂的制备及其吸附性能[J];离子交换与吸附;1999年01期

2 李乃宏,杨彦,左榘,袁直,何炳林;抗核酸抗体免疫吸附剂的制备及性能研究[J];中国生物医学工程学报;1985年03期

3 何炳林,郭贤权,吴向东;新型生物学活性免疫吸附剂的研究进展[J];材料导报;1994年05期

4 邵新华,张卫民,王凤桐,李涛,宋继昌;DNA免疫吸附剂免疫活性的长期观察[J];生物医学工程与临床;1999年01期

5 张秀敏;国建琴;苏晓辉;徐秀林;;类风湿因子免疫吸附剂的制备及性能研究[J];生物医学工程与临床;2010年05期

6 袁萍,邵新华,宋继昌;DNA免疫吸附剂治疗SLE患者的临床观察[J];上海免疫学杂志;1999年03期

7 李湛勇,史林启,宋正纪,梁树人;单克隆抗体免疫吸附剂的制备及对乙型肝炎表面抗原的吸附[J];高分子学报;1998年04期

8 沈s輙2;王世中;;溴化氰活化琼脂糖免疫吸附剂的简易制备法及其应用[J];生理科学进展;1979年02期

9 裘丽姝,陶义训;酶连免疫吸附剂测定[J];上海免疫学杂志;1982年03期

10 杨振修，陈宪莲，陶义训;银强化金标记免疫吸附剂试验的方法学研究[J];上海免疫学杂志;1996年01期

相关会议论文 前1条

1 俞耀庭;王连永;陆静;陈长治;;DNA包埋炭化树脂RF免疫吸附剂性能研究[A];21世纪医学工程学术研讨会论文摘要汇编[C];2001年

相关博士学位论文 前1条

1 孙昌元;重症肌无力特异性免疫吸附剂的制备及其性能研究[D];延边大学;2012年

相关硕士学位论文 前5条

1 尹春燕;类风湿因子免疫吸附材料的制备和性能研究[D];天津大学;2006年

2 郝兰;人PTH的表达纯化及其免疫吸附剂的制备[D];大连理工大学;2013年

3 金权鑫;重症肌无力特异性免疫吸附剂的制备及对患者血清的动态吸附试验[D];延边大学;2008年

4 胡俊;重组rSPA免疫吸附剂的合成过程优化和性能评价[D];南方医科大学;2014年

5 孙昌元;重症肌无力特异性免疫吸附剂血液相容性的研究[D];延边大学;2006年

，

本文编号：2229856