【摘要】：Ⅲ型干扰素是近年来发现的由被感染的细胞和某些免疫细胞如浆细胞样树突细胞(p DCs)产生的具有与Ⅰ型干扰素相似功能的细胞因子。目前已经发现四个成员,分别命名为IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)、IFN-λ3(IL-28B)和IFN-λ4。它们与由IL-28R1和IL-10R2亚基组成的受体复合物结合,通过JAK-STAT信号通路发挥抗病毒等生物学作用。人Ⅲ型干扰素基因位于19号染色体长臂上,即19q13.13。IFN-λ1和IFN-λ2基因位于正链,IFN-λ3和IFN-λ4基因位于负链。IFN-λ1由5个外显子组成,IFN-λ2和IFN-λ3由6个外显子组成。IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的启动子区域包含干扰素调节因子3(IRF3)和IRF7的结合位点和至少一个有功能的NFκB结合位点。IFN-λ1的N端为19个氨基酸的信号肽,IFN-λ2和IFN-λ3的N端为25个氨基酸的信号肽。当信号肽被切下后形成成熟的181个氨基酸的IFN-λ1或者175个氨基酸的IFN-λ2和IFN-λ3。IFN-λ4由IFNL4-delta G等位基因表达而来。其等位基因IFNL4-TT编码IFN-λ4假基因,不表达有功能的蛋白质。尽管IFN-λ4与其它3个Ⅲ型干扰素家族成员的同源性很低,但其结构与其它3个成员相似,并且同样与IL-28R1/IL-10R2受体结合,通过JAK-STAT信号通路,发挥功能。最近的研究发现IFN-λ3基因上游的单核苷酸多态性(SNP)与PEG-IFN-α联合利巴韦林治疗丙型肝炎的应答相关。该SNP也与机体自发清除丙型肝炎病毒的能力相关。此外,IFN-λ4基因的单核苷酸多态性也与PEG-IFN-α联合利巴韦林治疗丙型肝炎的应答及机体自发清除丙型肝炎病毒相关。人Ⅲ型干扰素受体的IL-28R1亚基的基因il28ra位于1号染色体1p36.11处,包含7个外显子,所转录的m RNA存在3种剪接方式,可以产生3种不同的m RNA。IL-28R1全长520个氨基酸,其N端为20个氨基酸的信号肽。IL-28R1亚基由208个氨基酸的细胞外结构域、23个氨基酸的跨膜区及271个氨基酸的细胞内结构域组成。IL-28R1细胞外结构域有4个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点,细胞内结构域有3个酪氨酸残基位点。其中Tyr343和Tyr517为STAT2和STAT5激活所必须。人Ⅲ型干扰素受体的IL-10R2亚基的基因il10r2位于21q22.11处,包含7个外显子,编码一条325个氨基酸的多肽,该多肽N端为19个氨基酸的信号肽。IL-10R2的细胞外结构域有4个N-糖基化位点和4个O-糖基化位点。IL-10R2细胞内结构域由79个氨基酸组成。IL-28R1是Ⅲ型干扰素专有的受体亚基,主要在粘膜上皮细胞和肝细胞中表达。IL-28R1表达的细胞特异性决定了Ⅲ型干扰素的靶细胞特异性。而IL-10R2则是IL-10、IL-22、IL-26和Ⅲ型干扰素的共用受体亚基,其表达不具有细胞特异性。Ⅲ型干扰素与IL-28R1亚基结合,使之IL-10R2亚基结合形成受体复合物,进而启动信号转导。Ⅲ型干扰素除了具有直接抗病毒的活性以外,还可以通过上调MHCⅠ分子调节免疫应答,发挥抗病毒作用。大量研究表明,Ⅲ型干扰素是抵抗病毒感染粘膜上皮细胞的最重要免疫因子。但不同于Ⅰ型干扰素的严重而广泛的副作用,Ⅲ型干扰素因其受体表达的特异性而限制了其作用的靶细胞范围,降低了其副作用。因此,Ⅲ型干扰素在防治呼吸道和胃肠道病毒感染中极具应用前景。Ⅲ型干扰素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖。Ⅲ型干扰素通过上调细胞周期调节因子p21的表达和促进Rb的去磷酸化,诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖;同时,通过诱导凋亡蛋白TRAIL等的表达,诱导癌细胞凋亡。Ⅲ型干扰素通过特定的靶细胞在抗病毒感染、肿瘤固有免疫防御方面发挥重要作用。但是,尽管Ⅲ型干扰素在预防和肿瘤发生、病毒感染和自身免疫性疾病中发挥重要作用,目前只有PEG-IFN-λ1治疗丙型肝炎病毒感染的方案进行了临床试验。PEG-IFN-λ1治疗丙型肝炎的Ⅱ期临床试验结果显示PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α疗效相似。与PEG-IFN-α相比,在12周前PEG-IFN-λ1可以更快的抑制病毒复制。在第24周时,PEG-IFN-λ1的病毒抑制率则与PEG-IFN-α基本相同。但是PEG-IFN-λ1治疗的副作用很小。在接受PEG-IFN-λ1治疗的患者中,很少发生嗜中性白细胞减少症和血小板减少症。尽管Ⅲ型干扰素具特异的抗病毒活性,且副作用很小,但是与Ⅰ型干扰素相比,其抗病毒活性要低很多。因此提高Ⅲ型干扰素的抗病毒生物活性具有重要意义。此外,在III型干扰素所有成员中,IFN-λ3的抗病毒活性最高,但只有IFN-λ1可以在原核表达系统里高效表达,导致目前在临床开发中的III型干扰素是IFN-λ1,而不是活性最高的IFN-λ3。近数十年对?干扰素的研究表明,将干扰素蛋白分子的序列稍做改变,有时可以使其在某一方面的活性(抗病毒或抑制细胞增殖)大大提高,如IFN-con和经DNA shuffling产生的超级干扰素等。因此,结合IFN-λ1易于在原核表达系统中表达和IFN-λ3高抗病毒活性的特点,本文通过用IFN-λ1的序列置换IFN-λ3相对应序列的方法设计了9个Ⅲ型干扰素嵌合体。为了避免产生免疫原性,我们选择在IFN-λ1和IFN-λ3的序列完全相同的区域进行置换,因此所设计的Ⅲ型干扰素嵌合体分子全都不带任何非天然氨基酸序列。本文第一次系统地研究了IFN-λ1/3嵌合体的表达和纯化,并且进行了PEG修饰。随后我们细致地研究了IFN-λ1/3嵌合体的活性和稳定性。发现PEG-analog-6诱导ISRE-luciferase报告基因表达的效率高于Ⅰ型干扰素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6和PEG-analog-7可以有效抑制丙型肝炎病毒和A型流感病毒的复制。并且PEG-analog-6和PEG-analog-7抑制流感病毒H3N2的效率高于Ⅰ型干扰素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6还可以抑制肺癌细胞株HCC827的增殖,诱导HCC827细胞STAT1磷酸化。此外还发现PEG-analog-6可以诱导HCC827细胞表达APOBEC3G。本文采用同家族基因序列置换的方法设计嵌合体蛋白质,并且证明了所设计的嵌合体蛋白质生物活性获得显著提高。此蛋白质设计方法避免了引入非天然蛋白质序列所引起的免疫源性问题,可用于设计和筛选安全有效的蛋白质工程药物。本文的实验结果如下:1.通过将Ⅲ型干扰素不同亚型之间的序列进行置换的方法设计干扰素嵌合体,并进行表达纯化。发现以IFN-λ1序列为N端的嵌合体可以在大肠杆菌里高效表达和纯化,而以IFN-λ3序列为N端的嵌合体则不能在大肠杆菌里表达。开发了一整套嵌合体干扰素的表达纯化和修饰的工艺。2.通过检测经嵌合体干扰素处理的Hep G2细胞Mx A和OAS的表达,证实4种嵌合体干扰素具有诱导干扰素应答基因表达的活性。其活性与浓度呈正相关,并且具有时间效应。3.通过检测干扰素信号通路关键蛋白STAT1的磷酸化与否,证实嵌合体干扰素可以诱导STAT1发生磷酸化,从而诱导干扰素应答基因的表达。4.通过ISRE-luciferase报告基因细胞系定量研究嵌合体干扰素的活性,证实analog-6和analog-7的活性高于IFN-λ1,PEG-analog-6的活性比PEG-IFN-α2a高5倍,PEG-analog-7的活性与PEG-IFN-α2a接近。5.通过免疫荧光染色和实时定量PCR的方法证明了PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合体干扰素能够抑制丙型肝炎病毒复制,其活性与PEG-IFN-α2a接近。6.通过ELISA的方法证实PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合体干扰素能够抑制流感病毒的复制,并且PEG-analog-6的活性高于PEG-IFN-α2a。7.通过检测放置于40℃的不同批次的嵌合体干扰素PEG-analog-6的浓度和纯度变化的方法,证明PEG-analog-6蛋白具有高度的稳定性。8.通过测定嵌合体干扰素对不同肿瘤细胞增殖的作用,发现嵌合体干扰素PEG-analog-6可以抑制肺癌细胞HCC827的增殖,诱导HCC827细胞凋亡,表达APBOEC3G。因此证实了嵌合体干扰素PEG-analog-6具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,其活性高于PEG-IFN-λ1。本文研究结果表明嵌合体干扰素PEG-analog-6具有易于在大肠杆菌中表达和纯化,稳定性好,能够诱导干扰素应答基因的表达,具有很高的抗病毒和抑制肿瘤细胞增殖的活性,为将其开发成蛋白质药物奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91
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2251942
