金纳米粒在肿瘤相关巨噬细胞的粒径依赖性定位和渗透研究

发布时间：2018-10-25 10:28

【摘要】：肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,对肿瘤的生长,血管生成,免疫抑制,转移和化学抗性等方面有着复杂和多样作用。特别是经极化后的巨噬细胞表现出了完全相反的免疫特性,显著影响着癌症治疗的临床效力。此外,伴随着激酶抑制剂和细胞因子类药物的快速发展,肿瘤相关巨噬细胞作为一种具有免疫治疗潜力的潜在靶标而受到了越来越广泛的关注,靶向肿瘤相关巨噬细胞的相关研究亦在逐步深入。面对上述问题,本研究选择理化性质稳定,制作方法简易,形态可控性极高的无机纳米粒子球型金纳米粒作为考察对象,平行其他因素,深入探讨金纳米粒体内和体外对肿瘤相关巨噬细胞定位和渗透能力的粒径依赖性。以期为筛选合适粒径的纳米粒用以靶向肿瘤相关巨噬细胞提供重要依据。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)无毒、无刺激性,具有良好的水溶性同时兼具良好的生物相容性,且由于其抗蛋白吸附能力极强,是被广泛应用的网状内皮系统隐形材料。本课题将利用PEG的这些特性对金纳米粒进行聚乙二醇化修饰,进而考察纳米粒在肿瘤相关巨噬细胞的粒径依赖性定位和渗透。建立HS-PEG-FITC的荧光线性方程:Y=191.95X+10.319 R2=0.9998,线性范围为:0.25~2.5μmol/L,用于调整对金纳米粒进行聚乙二醇化修饰时,HS-PEG-NH2和HS-PEG-FITC的比例,使得异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)能够定量的标记不同粒径的金纳米粒,以满足后期进行流式细胞实验和共聚焦观察细胞内定位的实验要求。选择巨噬细胞细胞株RAW264.7、鼠源肝癌细胞Hepa1-6和人源乳腺癌细胞MCF-7三株细胞系为实验细胞。利用细胞共培养技术建立肿瘤细胞和巨噬细胞共培养模型,对实体肿瘤微环境利用细胞系进行体外模拟。并进行体外细胞摄取和共培养条件下细胞摄取实验,结果显示,5nm和20nm相比于粒径较大的金纳米粒细胞渗透的能力较强,同时巨噬细胞细胞内化的程度要显著高于肿瘤细胞;在共培养条件下,巨噬细胞的摄取情况基本无变化,而肿瘤细胞摄取的纳米粒的量呈现略微下降的趋势。在细胞共培养模型中进行巨噬细胞的迁徙实验中,20nm的Au NPs表现出了较其他粒径纳米粒更强的诱导巨噬细胞聚集的能力。选择C57BL/6雄性小鼠和BALB/c雌性小鼠分别建立原位肿瘤模型,并结合梯度密度离心法和磁珠分选法对实体肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞进行提取和纯化,同时从健康小鼠腹腔内提取巨噬细胞作为对照,对TAMs进行细胞摄取实验。结果显示,20nm的Au NPs的在TAMs中的细胞内化程度最高,用Au-PEG-FITC进行流式细胞术和激光共聚焦观察的结果也同样证实了这一结果;与此同时,激光共聚焦观察结果显示,5nm Au NPs相较其他粒径较大的纳米粒具有较为理想的细胞核内定位效果。构建小鼠乳腺癌模型并进行体内摄取实验,选取先前实验结果较为理想的5nm和20nm粒径的Au NPs作为考察对象,通过体内局部注射,体外流式检测的方法对纳米粒的渗透进行考察。结果显示,5 nm Au NPs渗透效果略好于20 nm,但并无显著性差异;同时,在体内肿瘤微环境中,TAMs以不足10%的细胞比例摄取总量接近达到了肿瘤细胞的摄取总量的50%,可见较低粒径的Au NPs对TAMs渗透效率远远高于肿瘤细胞。本研究以纳米金粒子作为工具和主要实验对象,并对其做功能化修饰,深入探讨粒径为5~100 nm的金纳米粒对TAMs在体内外渗透和定位的粒径依赖性。结果显示,低粒径的纳米粒在体内外对肿瘤相关巨噬细胞的渗透作用上体现出了独特的优势,其内化程度也远高于肿瘤细胞;相较而言,5nm的Au NPs在细胞核内定位效果良好,20nm的Au NPs对巨噬细胞的募集能力更强。本研究可以为靶向肿瘤相关巨噬细胞纳米载体设计和功能化选择提供依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

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本文编号：2293438