抗埃博拉病毒反义寡核苷酸AVI-7537中间体合成与工艺优化研究

发布时间：2018-10-25 10:56

【摘要】：埃博拉病毒为丝状病毒科单股负链RNA病毒,最初于苏丹南部和刚果(金)的埃博拉河地区发现,可通过与携带病毒的动物或人接触传染,且一旦感染致死率极高,其生物安全等级为4级,高于SARS病毒与HIV病毒,为对人类危害最为严重的病毒之一。基于磷酰胺吗啉寡核苷(Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides,PMOs)结构的抗埃博拉病毒反义寡核苷酸AVI-7537为美国Sarepta Therapeutics公司(前AVI公司)研发的,由19个吗啉代核苷以磷酰胺结构连接而成的寡链,其可选择性与埃博拉病毒核衣壳相关蛋白VP24的m RNA起始密码子及下游结合,通过位阻作用使得对应蛋白无法正确合成,最终抑制病毒感染进程。已有研究表明该寡链可有效提升灵长类动物感染埃博拉病毒后的存活率。PMOs结构的类模块化结构亦可通过改变组合方式实现寡链长度与碱基序列排列的变化以结合不同的RNA序列,从而实现不同功能,尤其在抗病毒和治疗遗传病方面有着较为突出的优势。因此,对此结构研究也是为建立基于PMOs结构的反义寡核苷酸类药物平台建立一定的理论和物料基础。本研究主要基于现有文献资料,对目标反义寡核苷酸链合成中的所有中间产物进行合成方法研究与合成工艺优化,具体如下:研究目的:基于抗埃博拉反义寡核苷酸链AVI-7537,对所有PMOs成链前关键中间产物进行合成研究,并进行相关的结构确证。对各关键中间产物合成方法进行优化研究,获得一条高效、便捷、适合放大的合成路线。对PMOs结构单元吗啉代核苷单体进行物料积累,建立吗啉代核苷单体物质库,为基于PMOs结构的反义寡核苷酸药物的进一步研究建立一定理论和物质基础。研究内容:(1)吗啉代核苷单体合成研究:以碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、5-甲基尿嘧啶(T)、N4-苯甲酰胞嘧啶(C)的核苷为原料,对其结构中的核糖部分进行结构改造,使其形成吗啉核苷结构,并对相关基团进行保护,使之成为吗啉代核苷单体。(2)吗啉代核苷单体合成工艺优化研究:通过对不同方法的尝试及改进,对吗啉代核苷单体的合成方法进行优化,以得到操作便捷,收率较高,同时成本较为低廉的吗啉代核苷单体合成工艺。(3)磷酰胺主干结构的合成和工艺优化研究:对AVI-7537中存在的二甲氨基磷酰二氯,以及N-(三氟乙酰基哌嗪基)-N-磷酰二氯2种主干连接体进行合成研究,并对合成工艺进行探索与优化。(4)磷酰胺吗啉代核苷的合成研究:以2种主干连接体与4种吗啉核苷单体作为原料,进行PMOs结构成链单体磷酰胺吗啉代核苷的合成研究,最终形成6种可直接合成AVI-7537及其他PMOs结构所需成链前单体,包括4种磷酰二甲胺吗啉代核苷单体以及2种磷酰哌嗪吗啉代核苷单体。-(5)关键化合物的结构分析研究以及吗啉代核苷单体物质库的建立:对本研究中的关键化合物结构进行结构分析与确证,以确保所合成结构的正确性,并对吗啉代核苷单体进行物料积累,建立吗啉代核苷单体物质库,为AVI-7537反义寡核苷酸链或其他基于PMOs结构的反义寡核苷酸链研究打下一定的理论基础和物质基础。研究结果:(1)吗啉代核苷单体合成研究:分别以鸟苷、腺苷、N4-苯甲酰基胞苷和5-甲基尿苷作为原料,对N2-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代鸟苷、N6-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代腺苷、N4-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代胞苷和7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代胸苷4种吗啉代核苷单体进行了合成。其中N2-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代鸟苷、N4-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代胞苷和7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代胸苷使用了“碱基伯氨保护(鸟苷)→吗啉环合成→吗啉环仲氨基三苯甲基保护”的路线1,N6-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代腺苷则使用了“吗啉环合成→吗啉环仲氨基三苯甲基保护→碱基伯氨保护(腺苷)”的路线2。(2)吗啉代核苷单体合成工艺优化研究:分别对4种吗啉代核苷单体的两条合成路线进行了优化,与有完整详细报道的文献资料相比,采用优化后工艺,以路线1合成的N4-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代胞苷总收率达60.8%,比文献报道收率高11.8%,7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代胸苷总收率为43.2%,与文献报道基本持平,N2-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代鸟苷收率26.9%,为未见报道的全新化合物,该工艺有操作方便、成本较低、收率可观的优点,适合放大合成。采用优化后工艺,以路线2合成的N6-苯甲酰基-7?-羟基-N-三苯甲基吗啉代腺苷在反应时间、产物纯化便捷性上与原方法相比有较大优势,适合放大合成,虽13.6%的收率低于文献报道所述,但依旧远高于按文献方法重复所得,产生该结果原因可能与所用试剂有关。(3)磷酰胺主干连接体结构的合成和工艺优化研究:对连接体结构一,即N-(三氟乙酰基哌嗪基)-N-磷酰二氯的合成方法进行了研究,对其合成步骤进行了部分优化,相比原工艺操作难度和部分物料使用量有所降低。对连接体二,即二甲氨基磷酰二氯的合成方法进行了研究与筛选,确定了该物质的最佳合成方法。N-(三氟乙酰基哌嗪基)-N-磷酰二氯与二甲氨基磷酰二氯的总收率分别为40.3%和75.4%。因连接体分子长期保存易变质,故未对二者进行大量物料积累。(4)磷酰胺吗啉代核苷单体的合成研究:对AVI-7537中出现的直接参与成链的6种磷酰吗啉代核苷单体结构进行了合成研究,包括4种磷酰二甲氨基吗啉代核苷单体和2种磷酰哌嗪基吗啉代核苷单体。其中碱基为胸腺嘧啶的2种磷酰胺吗啉代核苷单体收率相对较高,均超过40%,碱基为N2-苯甲酰基鸟嘌呤的磷酰胺吗啉代核苷单体收率较低,仅14.7%,其余3种磷酰胺吗啉代核苷单体收率均约为30%。由于磷酰胺吗啉代核苷并不稳定,故未进行物料积累。(5)关键化合物的结构确证以及吗啉代核苷单体物质库的建立:对4种吗啉代核苷单体,2种磷酰胺连接体和6种磷酰胺吗啉代核苷单体以及合成中关键步骤中间产物进行了核磁或高分辨质谱测定,保证了所合成物质结构的准确性。对PMOs合成中的最关键中间产物即4种吗啉代核苷单体均进行了各数十克的物料积累,充分满足了后续AVI-7537寡链以及其他基于PMOs结构反义寡核酸链的研究需求,为相关研究奠定了一定的物料基础。目前国内尚未见有PMOs合成相关研究。本研究无论是对国内抗埃博拉病毒药物研究方面,还是在其他基于PMOs结构的反义药物研发方面均可起到一定积极的促进作用。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R914

【参考文献】