叶酸受体靶向伊马替尼脂质体及阿霉素—伊马替尼复方脂质体的研究

发布时间：2018-10-26 18:20

【摘要】：血小板衍生生长因子受体(PDGFR)在宫颈癌组织中有高水平的表达,且在宫颈癌的发生和发展过程中发挥着重要的作用。PDGFR是甲磺酸伊马替尼(IM)的主要作用靶点之一,体外研究证明,IM能够与PDGFR上的特殊位点结合,阻断受体磷酸化,从而导致宫颈癌细胞的凋亡和死亡。但当IM在临床上用于治疗宫颈癌疾病时,疗效却很不显著。药物向肿瘤组织传递的不充分以及IM高的血浆蛋白结合率在很大程度上导致了这种失败。脂质体作为一种纳米级药物传递系统能够发挥靶向肿瘤的作用。因此本研究通过将IM装载入脂质体中,并在制备脂质体的材料中加入叶酸修饰的脂质材料,制成叶酸受体靶向伊马替尼脂质体,从而实现IM对宫颈癌组织的靶向传递,同时减少药物和血浆蛋白的结合,提高IM的治疗效果。研究表明,IM还能增强肿瘤细胞对传统细胞毒类抗癌药的化疗敏感性。在多种类型肿瘤的体外研究中,IM与细胞毒类抗癌药的联用能产生相加或协同的抗肿瘤效果。但药物联用效果在很大程度上受联用药物比例的影响,而这种固定的比例在全身给药时很难实现,因为药物有各自不同的体内代谢过程。因此,我们尝试按一定的比例将IM和阿霉素(DOX)同时包入叶酸受体靶向脂质体中,从而同步两药的体内过程,使两药在到达肿瘤组织后能维持合适的比例,发挥协同作用,进一步提高疗效、降低毒性、减少耐药的产生。在第一章中,我们运用scifinder数据库,对IM的理化性质进行评价。IM具有弱碱性药物的特征,在碱性环境下,油水分布系数高,呈现脂溶性,溶解度随pH值得升高而降低。建立了测定脂质体中IM含量的分析方法,运用琼脂糖凝胶柱CL-4B分离脂质体和游离药,并运用HPLC测定脂质体中IM含量。选择硫酸铵梯度法进行叶酸受体靶向伊马替尼脂质体(FLI)的制备,同时以包封率为指标,对磷脂和胆固醇的比例、硫酸铵的浓度、磷脂浓度、药脂比四个影响因素进行单因素考察,结果显示,在氢化大豆磷脂(HSPC)和胆固醇(CHOL)的比例为55：40,硫酸铵溶液浓度为300mM,磷脂浓度为35mg/mL,药脂比为1：5的条件下,能取得较高的包封率,三批样品的平均包封率为90.7±0.91%。在第二章中,对FLI的外观、粒径及分布、表面电荷、体外释放、以及储存稳定性进行了考察。FLI为浅黄绿色的半透明混悬溶液,色泽均匀,流动性良好。FLI三批样品的平均粒径为143.5±2.96nm,多分散指数为0.123±0.017, Zeta电位为-15.97±1.89mv。从透射电镜上看,FLI为圆形或类圆形,大小均一。运用动态透析法考察了FLI的体外释放情况,在pH7.4的PBS中,药物释放非常缓慢,经过72h的孵育,只有不到5%的药物释放；而在pH5.5的PBS中,药物释放加快,72h累计释放率达到29.5%左右,说明FLI具备一定程度的pH敏感性。FLI在4℃冰箱保存30天,以粒径和脂质体中药物存留百分比为指标考察脂质体储存稳定性,结果显示稳定性良好。在第三章中,选择叶酸受体(FR)和PDGFR双阳性的宫颈癌Hela细胞来考察FLI的靶向性和抗肿瘤效果。用荧光染料Calcein标记脂质体,用荧光显微镜和流式细胞分析仪来定量和定性考察Hela细胞对叶酸受体靶向荧光脂质体(FLC)的摄取。荧光显微镜观察的结果显示FLC能在叶酸受体调节的内吞作用下被Hela细胞特异性摄取,而且这种作用能够被游离叶酸阻断。流式细胞分析的结果也映证了这一点,经过与Hela细胞共同孵育1小时,FLC组的荧光强度是非靶向荧光脂质体(LC)组的近40倍。运用MTT法比较了FLI和LI对Hela细胞的增殖抑制作用,结果显示FLI具有更强的抗肿瘤效果,其对Hela细胞的增殖抑制作用是LI的6倍。进一步考察了FLI诱导Hela细胞凋亡的能力,结果显示相比LI, FLI能通过分子靶向和主动靶向的结合诱导更多的细胞凋亡。在第四章中,选择昆明雌性小鼠考察FLI、LI、以及游离IM在小鼠体内的药代动力学特征。建立HPLC测定血浆中IM含量的方法学。将测得的不同给药组各时间点的血药浓度对时间做图,绘制血药浓度经时曲线,并用WinNonlin软件计算各药动学参数。从结果来看,相比游离药,脂质体形式具有更大的曲线下面积,更低的体内清除率,更长的消除半衰期和滞留时间,体现出明显的长循环特征。这种药动学特征有利于脂质体加强对肿瘤组织的灌注,发挥被动靶向肿瘤的作用。在第五章中,选择MTT法检测伊马替尼(IM)和阿霉素(DOX)单用或联用对Hela细胞的增殖抑制率,并选用半效方法(Median-effect Method)和药物联用指数(CI, combination index)来评价两药联用的效果,同时筛选合适的联用比例。两种药物单独使用时,均能有效抑制Hela细胞的生长增殖,且呈浓度依赖性。相比IM, Hela细胞对DOX的敏感性更强,其IC50是IM的1/26。两药联用比DOX单用均表现出更强的肿瘤细胞生长抑制作用。运用CI值对两药联合作用进行评价,发现三种不同比例的DOX和IM联合作用于Hela细胞在高效应区均表现出协同抗肿瘤作用(CI1),说明伊马替尼能提高肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。当DOX和IM的比例为1：15时,CI值最小,协同作用最强,故选择该比例制备阿霉素-伊马替尼复方脂质体。在第六章中,建立了测定脂质体中DOX含量的分析方法,运用琼脂糖凝胶柱CL-4B分离脂质体和游离药,并运用HPLC测定脂质体中DOX含量。在FLI处方优化的基础上,选择硫酸铵梯度法制备叶酸受体靶向阿霉素-伊马替尼联合脂质体(FLDI),并以IM包封率和联用药比例为指标,进一步考察药脂比和载药顺序对FLDI制备的影响,结果显示在药脂比为1：8,将DOX和IM混合后同时载入脂质体能得到比较理想的结果。同时,还对叶酸受体靶向阿霉素-伊马替尼复方pH敏感脂质体(FPLDI)进行了研制,以改良的硫酸铵梯度法制备,考察磷脂比例、水化溶液pH值、磷脂浓度和药脂比对脂质体制备的影响。结果显示,在DOPE和CHEMS的比例为6：4,硫酸铵pH值为8.5,磷脂浓度为55mg/mL,药脂比为1：8的条件下,能取得较高的包封率和理想的药物比例。在第七章中,对两种叶酸受体靶向阿霉素-伊马替尼复方脂质体(FLDI和FPLDI)的外观、粒径、表面电荷、体外释放性能、融合性能以及储存稳定性进行了考察。两种脂质体均为半透明红色均一的混悬液。FLDI的粒径和电位分别为145.6+1.26nm和-16.41±1.73mv, FPLDI的粒径和电位分别为170.2+2.47nm和-36.45±2.56mv。从透射电镜上看,两种脂质体均为圆形或类圆形,大小均一。运用动态透析法考察了两药的体外释放情况,无论FLDI还是FPLDI在pH7.4的环境中,DOX和IM的释放均不足5%;而在pH5.5的环境中,DOX和IM从FLDI中的释放有所提高分别为11.2%和19.3%,但相比叶酸受体靶向阿霉素单药脂质体FLD,复方脂质体FLDI中DOX的释放明显减慢,24h的累积释放率降低了近60%。与此不同,FPLDI在酸性环境中表现出非常强的pH敏感性,两种药物从FPLDI中的释放显著加快并基本同步,24h累计释放率均达到90%左右。FLDI在两种pH环境中均不具有融合性能,而FPLDI在pH5.5的环境中,粒径迅速增大,脂质体发生融合。两种脂质体在4℃冰箱保存30天,以粒径和脂质体中药物存留百分比为指标考察脂质体储存稳定性,结果显示两种脂质体在该条件下稳定性较好。在第八章中,运用荧光显微镜法和流式细胞分析仪考察了Hela细胞对两种叶酸受体靶向复方脂质体FLDI和FPLDI的特异性摄取。荧光显微镜观察的结果显示这两种脂质体均能在叶酸受体的介导下被Hela细胞特异性摄取,而且这种作用能够被叶酸阻断。流式细胞分析的结果也证实,经过与Hela细胞共同孵育1小时,FLDI组和FplDI组的荧光强度分别是是非靶向脂质体LDI组和PLDI组荧光强度的7.5和8.4倍。本章还运用MTT法比较了复方脂质体和单药脂质体对Hela细胞的增殖抑制效果,FPLDI、FPLD、FLDI、FLD的IC50值分别为2.89±0.34、5.22±0.56、14.8±1.53、9.38±0.83uM。相比FPLD, pH敏感复方脂质体FPLDI能够通过药物联合作用显著增强对Hela细胞的增殖抑制效果。而非pH敏感的复方脂质体FLDI对Hela细胞的作用效果却不如单药脂质体FLD,因为IM在复方脂质体内水相形成的胶态沉淀限制了DOX的释放。综上所述,叶酸受体靶向伊马替尼脂质体能够通过分子靶向和主动靶向作用的联合增强伊马替尼对宫颈癌Hela细胞的凋亡和杀伤作用,将是一种很有潜力的治疗策略应用于宫颈癌的治疗中。叶酸受体靶向阿霉素-伊马替尼复方pH敏感脂质体能够同步联用药物的体内过程,在靶组织迅速释放药物并保持合适的药物联用比例,从而发挥伊马替尼和阿霉素的协同作用,显著增强对宫颈癌Hela细胞的杀伤作用,将为宫颈癌药物联合治疗提供新的方向。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】