蛋白激酶C抑制剂对抗伊马替尼和苏尼替尼导致的心肌细胞毒性

发布时间：2018-11-10 21:46

【摘要】：蛋白激酶在多种疾病，，特别是肿瘤发生发展过程中起重要作用，以其为药物靶点的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors， TKIs）则成为近年药物研发的热点。已上市药物已经在多种肿瘤的治疗中显示出其较传统治疗药物的优越性，部分已成为治疗肿瘤的一线用药。但是随着这些药物的应用，其不良反应也逐渐暴露出来，其中较为严重的是心脏毒性。TKIs引起的心脏毒性主要表现为慢性充血性心力衰竭[12,17,38,45,46],一经发生，对患者健康将造成严重影响。因此，研究TKIs导致的心脏毒性机制及其有效对抗药物显得尤为重要。临床已经报道具有心脏毒性的TKIs药物有伊马替尼，苏尼替尼，尼罗替尼，达沙替尼等，实验研究显示，在离体培养心肌细胞和整体动物模型上，伊马替尼（Imatinib，IM）和苏尼替尼（sunitinib，SU）均可导致明显线粒体功能异常[21,22]，目前引起上述线粒体损伤的细胞内分子机制尚不清楚，有实验表明伊马替尼会诱导离体培养的新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）中PKCδ表达水平明显增加[12]。已知蛋白激酶C（proteinkinase C, PKC）是一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起重要作用，能够调节细胞的代谢、生长、增殖和分化等。迄今，已鉴定出至少10种PKC亚型（异构体），依据它们的结构与激活机制分为三类：传统型PKC（cPKC，包括α、βI、βII和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ），非典型PKC（aPKC，包括ζ、/λ）。在近几年的研究中，发现PKC各亚型的过度激活参与了各种心脏疾病[20,31]。有研究表明，激活PKCδ会导致线粒体丙酮酸脱氢酶激酶激活,这抑制了丙酮酸脱氢酶和ATP再生并且还会触发细胞坏死[12,13,10]；因此，我们假定，PKC过度激活可能是此类药物产生心肌细胞毒性的重要途径。为验证我们的假设，本实验利用离体培养的新生大鼠心肌细胞（NRVMs），研究PKC抑制剂或抑制肽（主要研究心肌中富含的cPKCs和nPKCs中的PKCδ、ε亚型）对TKIs药物伊马替尼（Imatinib，IM）和苏尼替尼(Sunitinib,SU)导致的心肌细胞毒性作用的影响。研究对阐明TKIs类药物心脏毒性机制、防治心脏毒性提供实验依据。目的：研究cPKCs和PKCδ、ε亚型抑制剂或抑制肽对IM和SU导致的心肌细胞毒性作用的影响。方法：新生1-2天SD大鼠，分离心室肌细胞，用DMEM/F-12培养基培养三天，首先分别孵育不同浓度的IM（2、5、10M）和SU（1、5、10M），在48h用ATP检测试剂盒和FLUOstarOmega全自动多功能酶标仪检测细胞内ATP的含量，72h用LDH检测试剂盒和FLUOstar Omega全自动多功能酶标仪检测细胞外LDH释放量，线粒体膜电位检测试剂盒和激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位（MMP）的改变。然后，观察非选择性、选择性PKC抑制剂或抑制肽对IM和SU细胞毒性的影响。实验数据均用OriginPro8.6进行数据分析，采用平均数±标准误表示，n代表实验重复次数。两组间数据比较采用t检验，P0.05时认为两组间的差异具有统计学意义。结果： (1) IM和SU对NRVMs的毒性作用不同浓度IM（2、5、10M）和SU（1、5、10M）与NRVMs孵育48h细胞内ATP含量呈浓度依赖性减少，72h检测的LDH释放量亦随着浓度的增加而明显增多。分别孵育10M的IM和SU，于24、48及72h三个时间点检测细胞内ATP的含量，LDH释放量以及MMP变化。结果显示， IM和SU组的ATP含量于48h明显降低，约为对照组含量的50%，72h含量继续下降，只有对照组含量的20%；LDH的释放量在48h IM和SU显著升高，72h释放量继续升高，IM组是对照组的两倍，SU组是对照组的三倍。MMP测量显示，在24h，IM和SU组MMP均明显降低，IM组降低到对照组的50%，SU组降低到对照组30%，48、72h MMP呈继续降低趋势。上述结果表明，在离体培养NRVMs上，IM和SU能够产生明显心肌细胞毒性，并且毒性呈现浓度依赖性和时间依赖性，从检测的指标上看，线粒体膜电位的下降是最早出现的毒性表现。 (2)非选择性PKC抑制剂Bis-1对IM和SU毒性的影响在NRVMs中，Bis-1（100nM）分别与IM（2、5、10M）,和SU（1、5、10M）,孵育48h检测ATP含量,孵育72h检测LDH释放量。单独孵育Bis-1上述指标与对照组无明显差别，而加入Bis-1使三个浓度下IM和SU组的ATP含量和LDH释放量均恢复到对照组水平；单独孵育Bis-1对MMP无明显影响，Bis-1与IM或SU共孵育可显著逆转所有浓度MMP值的下降。透射电镜扫描结果显示， IM和SU引发线粒体形态发生显著变化，多数线粒体产生空泡、肿胀或髓样化改变。而共同孵育Bis-1的IM和SU组细胞中线粒体恢复正常形态。上述实验结果表明，非选择PKC抑制剂Bis-1对IM、SU导致的心肌细胞毒性有拮抗作用。 (3)选择性PKC抑制剂或抑制肽对IM和SU毒性的影响 G6976是cPKC抑制剂，G6976（100nM）与IM或SU共孵育并不影响MMP值、 ATP含量以及LDH的释放。同样，高选择性PKC抑制肽（500nM）对IM和SU引发的上述指标改变无明显影响，表明传统型PKC亚型抑制不能对抗IM和SU引起的心肌细胞毒性。Rotterlin是PKC选择性抑制剂,单独孵育Rotterlin（500nM）不影响MMP值、 ATP含量以及LDH的释放，但Rotterlin可完全取消IM和SU引起的上述各项指标的变化。选择性PKC抑制肽（500nM）亦可显著对抗IM和SU导致的各项指标的变化，而其乱码对照肽不能对抗IM或SU导致的各项指标的变化，表明选择性抑制新型PKC和PKC对IM和SU的心肌细胞毒性具有明显预防作用。为进一步确认Rotterlin和PKCε抑制肽预防心肌毒性的作用，我们利用透射电子显微镜检测了细胞线粒体亚显微结构。与IM引发的线粒体改变明显不同的是，Rotterlin与IM共孵育线粒体亚显微结构清晰，未见明显空泡、肿胀或髓样化改变；PKCε抑制肽存在下，IM虽然引发部分线粒体空泡化，但未见髓样化改变。Rotterlin和PKCε抑制肽对SU引发线粒体改变具有与IM相似的保护作用。以上实验结果表明，选择性抑制PKC δ和ε亚型能够一定程度上预防IM和SU的心肌细胞毒性，而传统型PKC亚型抑制不能对抗IM和SU引起的心肌细胞毒性。结论： (1) IM SU能够导致的心肌细胞毒性，并且毒性呈现浓度依赖性和时间依赖性，线粒体膜电位的下降是最早出现的毒性表现。 (2) PKC非选择性抑制剂Bis-1对IM、SU导致的心肌细胞毒性具有抑制作用。 (3)选择性新型PKC（而不是传统型）抑制可显著对抗IM和SU所致的细胞毒性。结果提示TKIs的心脏毒性机制可能与其新型PKC亚型活性增高有关，抑制这些PKC亚型可望有效防治TKIs类药物的心脏毒性。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

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