【摘要】：第一部分二甲双胍对培养大鼠海马神经元GABAA受体膜转运的调控 目的：二甲双胍(metformin)是一种安全有效的口服降糖药物,广泛用于治疗2型糖尿病。近年研究表明,二甲双胍促进海马新生神经元生长,并改善小鼠空间学习记忆。而大量研究发现,γ-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, GAB A)能神经传递在神经元分化、树突棘生长以及突触形成过程中起到至关重要的作用。鉴于神经再生与GABA能神经传递的密切关系,我们推测GABA能神经传递可能参与二甲双胍诱导的神经元再生,而GABAA受体的膜转运是影响抑制性突触传递的关键因素之一。因此,本实验研究二甲双胍对海马神经元GABAA受体膜转运的影响。 方法：采用细胞免疫荧光,蛋白交联的western blotting技术研究二甲双胍对原代培养大鼠海马神经元GABAA受体的膜转运的影响；采用全细胞膜片钳技术研究二甲双胍对原代培养海马神经元GABA能突触传递的影响。 结果：(1)二甲双胍促进原代海马神经元y2subunit-containing GABAA受体膜表达(190.30±12.67%of control, n=12, p0.01vs control)。(2) western blotting结果发现二甲双胍对γ2亚基-containing GABAA受体总蛋白表达无影响,但促进其膜表达(134.4±10.0%of control, n=5, p0.05vs control)。(3)二甲双胍增加海马神经元微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs)的幅度(193.9±20.0%of control, n=10,p＜0.01vs control)和频率(115.6±5.0%of control, n=10,p＜0.05vs control)。 结论：二甲双胍增加原代海马神经元抑制性突触后受体GABAA受体的膜表达,并增强该受体介导的抑制性突触后电流。 第二部分二甲双胍促进培养海马神经元GABAA受体膜转运的机制 目的：研究表明,GABA受体相关蛋白(GABA receptor-associated protein, GABARAP)通过与GABAA受体的γ2亚基相互作用,介导GABAA受体的转运。同时,GABARAP属于自噬相关基因8(autophagy-related protein8,Atg8)家族成员,在自噬发生过程中扮演重要角色,而Atg8家族成员的转录调控是依赖叉形头转录因子O亚型(forkhead box O3a, FoxO3a)的。另有大量证据表明,能量平衡调节关键激酶—腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine5'-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)激活FoxO3a,促使其进入细胞核,增加其转录活性。已知二甲双胍是经典的AMPK激动药,参与能量平衡的调节。由此,我们推测二甲双胍可能通过激活AMPK-FoxO3a信号通路,促进GABARAP的表达,进而增强GABARAP与GABAA受体的γ2亚基相互作用,从而增强海马神经元GABA能神经传递。因此,本实验探讨AMPK-FoxO3a-GABARAP信号通路在二甲双胍介导的(ABAA受体膜转运中的作用。 方法：采用免疫共沉淀检测二甲双胍对海马神经元GABARAP与GABAA受体的Y2亚基的相互作用；采用实时荧光定量PCR及western blotting检测二甲双胍对海马神经元GABARAP及FoxO3a mRNA和蛋白水平的影响。采用蛋白交联法,细胞免疫荧光技术、慢病毒沉默技术检测下调FoxO3a表达对二甲双胍诱导的GABARAP表达增加及GABAA受体膜表达的影响；采用染色质免疫共沉淀检测FoxO3a与GABARAP启动子的相互作用；采用药理学和分子生物学技术下调AMPK表达后,检测二甲双胍对GABARAP表达和GABAA受体膜转运的影响；免疫荧光检测二甲双胍对海马神经元FoxO3a细胞核转运的影响。 结果：(1)二甲双胍增加GABARAP表达(134.84±21.27%of control, n=5,p＜0.05vs control),并促进其与GABAA受体Y2亚基的相互作用(154.21±13.87%of control, n=3,p＜0.05vs control),从而促进GABAA受体膜转运。(2) FoxO3a参与二甲双胍诱导的GABARAP表达增加及GABAA受体膜转运。(3) AMPK参与二甲双胍诱导的FoxO3a的转录激活及GABAA受体膜转运。 结论：AMPK-FoxO3a-GABARAP信号通路介导二甲双胍促进海马神经元GABAA受体膜转运的作用。 第三部分二甲双胍快速拮抗大鼠焦虑样行为及其机制 目的：体外实验表明二甲双胍促进培养大鼠海马神经元GABAA受体膜表达。那么,二甲双胍是否能够通过同样的机制促进与焦虑相关脑区GABAA受体膜转运呢?此外,增强GABAA受体介导的抑制性突触传递能够起到很好的抗焦虑功能,根据这一特点,我们推测二甲双胍可能具有抗焦虑作用。因此,本实验探讨二甲双胍对焦虑样行为的影响。 方法：采用组织免疫荧光及蛋白交联法检测二甲双胍对成年SD大鼠海马CA1区椎体神经元GABAA受体膜表达的影响；采用旷场实验及高架十字迷宫实验检测二甲双胍对SD大鼠焦虑样行为以及自发活动的影响；采用western blotting技术检测二甲双胍对海马CA1区AMPK-FoxO3a-GABARAP信号通路的激活情况；采用免疫共沉淀检测二甲双胍对SD大鼠CA1区GABAA受体的γ2亚基与GABARAP的相互作用；采用旷场实验检测特异性小肽TAT-GABARAP能否阻断二甲双胍诱导的抗焦虑样行为；采用血糖试纸法检测二甲双胍对血糖的影响。 结果：(1)二甲双胍促进成年SD大鼠海马CA1区锥体神经元GABAA受体膜表达(130.02±7.19%of control,n=5,p＜0.01vs saline-treated)。(2)通过旷场实验(224.81±35.04%of saline-treated,n=12, p0.01vs saline-treated)及高架十字迷宫(163.82±18.47%of saline-treated, n=12,p＜0.01vs saline-treated)实验证实二甲双胍具有抗焦虑样行为的功能,且不产生耐受。(3)急性给予二甲双胍促进海马CA1区AMPK-FoxO3a-GABARAP信号通路的激活,增强GABAA受体γ2亚基与GABARAP的相互作用。(4)TAT-GABARAP能够阻断二甲双胍诱导的快速抗焦虑样行为。(5)二甲双胍在抗焦虑作用时不影响自发活动及基础血糖水平。 结论：二甲双胍具有快速抗焦虑样行为的作用,该作用与激活大鼠海马CA1区AMPK-FoxO3a-GABARAP信号通路的激活相关,阻断该脑区GABAA受体的γ2亚基与GABARAP的相互作用可以取消二甲双胍快速抗焦虑作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965
【共引文献】
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本文编号：
2373896
