半胱氨酰白三烯受体-2选择性拮抗剂HAMI 3379对脑缺血损伤的作用

发布时间：2018-12-27 18:59

【摘要】：研究背景：炎症变化是脑缺血再灌注后脑损伤的重要基础之一。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, CysLTs;包括LTC4. LTD4和LTE4)是一类重要的炎症介质,在脑缺血、脑外伤等中枢神经系统损伤性疾病中起重要作用。CysLTs通过激活半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl leukotriene receptor, CysLTR)起作用。目前,已克隆和鉴定了两种半胱氨酰白三烯受体(即CysLT1R和CysLT2R). 大鼠局灶性脑缺血后,CysLT1R表达上调,急性期表达在缺血中心区神经元,慢性期表达在缺血中心区激活的小胶质细胞以及周边区增生的星形胶质细胞。本课题组已经证实CysLT1R拮抗剂普鲁司特、孟鲁司特对大、小鼠局灶性脑缺血模型急性和亚急性/慢性损伤均具有保护作用。该类药物发挥神经元保护作用可能机制是抑制缺血急性期血脑屏障通透性增加并调节炎症反应,减少缺血后期星形胶质细胞增殖及胶质疤痕形成。 CysLT2R表达于心脏、脐静脉内皮细胞、提睾肌脉管系统、肠肌层神经元等外周组织细胞中；在人脑中,CysLT2R表达在血管平滑肌细胞及浸润的粒细胞上,而CysLT1R脑内表达相对较少。正常大鼠脑组织中,CysLT2R主要表达于脑室周围和皮层的星形胶质细胞；大鼠局灶性脑缺血损伤早期CysLT2R表达于缺血中心区神经元,后期表达于缺血中心区的小胶质细胞以及周边区的星形胶质细胞,同CysLT1R表达的时空特征相似。CysLT2R介导缺血诱导的PC12细胞的损伤；在星形胶质细胞中,CysLT2R还介导体外缺血损伤或LTD4处理后水通道蛋白AQP4的表达；这些结果提示,CysLT2R与脑缺血损伤密切相关,抑制CysLT2R通路可能是一条治疗脑缺血损伤的有效途径。 HAMI3379是近年来报道的CysLT2R选择性拮抗剂,HAMI3379对CysLT2R亲和力远强于CysLT1R(约10000倍)。另一种CysLT2R选择性拮抗剂Bay CysLT2可减轻小鼠心肌梗死、抑制LTD4诱导的耳静脉伊文思蓝渗出及大鼠动脉环微血管生成,减轻缺血性星形胶质细胞损伤。新近报道,HAM3379虽然对皮层神经元OGD/R诱导的损伤无明显作用,但可抑制皮层细胞混合培养体系中细胞活性下降及LDH释放,并通过抑制小胶质细胞激活,减少神经元死亡,但是,HAMI3379在整体水平上,对大鼠局灶性脑缺血损伤是否有保护作用还需进一步研究。已经证实CysLT2R可通过激活小胶质细胞介导缺血性神经元损伤。BV2细胞是小鼠胶质瘤细胞株,具有原代小胶质细胞的特性,已被广泛用于相关研究。那么CysLT2R拮抗剂HAMI3379及CysLT1R拮抗剂普鲁司特,对OGD诱导的BV2细胞激活是否有类似的保护作用,其有关的作用机制是什么?都有待于进一步研究。研究目的：本研究采用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)诱导的局灶性脑缺血再灌注模型,及缺氧缺糖(OGD)激活BV2细胞模型,研究CysLT2R选择性拮抗剂HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用,并阐明对HAMI3379对OGD诱导改变的BV2细胞激活作用及有关作用机制。实验主要分以下2个方面： (1)首先,以侧脑室注射为给药途径,初步观察HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血急性损伤的保护作用,并与CysLT1R拮抗剂普鲁司特比较。其次,用更接近临床的给药方法,进一步明确腹腔注射HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血急性及慢性损伤的保护作用。 (2)研究HAM3379及普鲁司特对OGD诱导的BV2细胞激活、细胞因子、自噬及受体间相互作用的影响。研究方法：用线栓法阻塞大鼠左侧大脑中动脉(MCAO),制备局灶性脑缺血模型；以神经症状评分和斜板实验观察动物神经功能损伤；用激光多普勒血流仪检测局部脑血流；以TTC染色法检测脑损伤面积及脑水肿；以甲苯胺蓝或尼氏染色观察神经元形态,以Fluoro-Jade B染色法观察变性神经元；以免疫组织化学法观察血脑屏障通透性的变化、小胶质细胞、激活的小胶质细胞、中性粒细胞和星形胶质细胞的变化；以免疫荧光组织化学法观察存活神经元、以CBA法检测大鼠血清及脑脊液中IFN-γ, IL-4, IL-10含量,以ELISA法检测大鼠鼠血清及脑脊液中IL-1β、IL-6. TNF-α含量。在离体实验中,MTT还原试验和LDH释放试验观察不同OGD时间及恢复时间对BV2存活的影响,确定诱导BV2细胞激活及损伤的OGD/R条件。免疫荧光共染法确定CysLT1R和CysLT2R表达,观察自噬的变化,用流式细胞仪检测BV2荧光微珠吞噬的吞噬功能,用流式细胞仪及Annexin V/PI试剂盒检测细胞凋亡的发生,用PLA法确定CysLT1R-CysLT2R相互作用。用CBA法测定BV2细胞的上清液中TNF、 IL-6的释放。用Real-time PCR法测定BV2细胞中IL-2, IL-6、 IL-17a. IL-10. EGR-2、 IL-4、 TNF和IFN-Y等细胞因子的变化。研究结果：第一部分HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用 HAMI3379侧脑室术前给药(100ng)对MCAO大鼠血糖、平均动脉压、二氧化碳分压、血氧分压,血糖、pH值及血流变化模式无影响。缺血再灌注24h后,HAMI3379(10,100ng)能显著地减少神经症状评分,提高斜板角度,减少梗死体积,减轻脑水肿,抑制神经元的丢失,坏死及缺血侧半球皮层及纹状体梗死区IgG渗出,该作用与普鲁司特相似。CysLT2R shRNA侧脑室注射可明显减少大鼠局灶性脑缺血／再灌注24h脑梗死体积及脑水肿,这些结果证明,HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血的急性损伤具有保护作用并且是CysLT2R依赖的。 HAMI3379腹腔注射给药(0.1mg/kg)对MCAO大鼠平均动脉压、血糖等生理指标无影响。各组间死亡率无显著差异。HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血急性期损伤的保护作用具有剂量及时间依赖性。HAM3379腹腔注射的有效剂量0.1-0.4mg/kg, HAMI3379腹腔注射的作用时间窗是1h。HAMI3379对大鼠缺血再灌注24,72h的损伤均具有改善作用,即可减少神经功能损伤、减轻脑梗死、脑水肿及缺血侧神经元丢失与坏死. HAMI3379可减少MCAO术后24h的血清、脑脊液中IL-1β、 EFN-Y-TNF-a释放。HAMI3379还可抑制MCAO术后72h缺血侧半球MPO浸润,抑制小胶质细胞激活,但对该时间点星形胶质细胞增生无明显抑制作用。与HAMI3379比较,CysLT1R拮抗剂普鲁司特对小胶质细胞的激活及IFN-γ释放无作用,但可抑制星形胶质细胞的增生,减少血清中IL-4的释放。上述结果表明,腹腔注射HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血再灌注后24～72h损伤具有保护作用,并且,可以减少小胶质细胞有关的炎症,进一步证实CysLT2R可作为脑缺血治疗的新靶点。 HAMI3379(0.1mg/kg, i.p.)术后连续给药6d,与普鲁司特作用相似,能显著减少大鼠MCAO术后0-7d的神经症状评分,提高斜板角度,减轻大鼠MCAO术后14d的脑萎缩,减少缺血周边区的神经元丢失,抑制小胶质细胞及星形胶质细胞的增生。以上结果提示HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血慢性损伤也有保护作用。第二部分HAMI3379对OGD诱导BV2细胞激活的影响 OGD1h后恢复(R)48h,可诱导BV2细胞适度激活,细胞激活后形态发生明显变化、炎症因子合成及释放增加,吞噬功能、细胞自噬增强,细胞的CysLT1R和CysLT2R表达上调,并发生核移位,且两者表达在时空分布变化上具有一致性。HAMI3379可逆转OGD/R诱导的细胞激活,减少炎症因子的合成和释放,抑制吞噬功能和细胞自噬增强,抑制CysLT1R和CysLT2R表达上调和核移位。普鲁司特与HAMI3379作用相似,但对吞噬功能无影响。PLA试验证明CysLT1R-CysLT2R间存在相互作用,OGD1h/R48h可增强这种相互作用；HAMI3379可抑制CysLT1R-CysLT2R相互作用,并能增加CysLT1R mRNA表达。结论： (1)在大鼠局灶性脑缺血模型,侧脑室给药初步证实HAMI3379对急性损伤的保护作用；腹腔注射给药对急性、亚急性损伤有保护作用,并可减轻炎症反应,尤其能较强抑制小胶质细胞激活,其有效剂量是0.1-0.4mg/kg,治疗时间窗为术后1h；对脑缺血慢性损伤亦有保护作用,促进神经功能恢复。其作用与CysLT1R拮抗剂普鲁司特相似,但也有不同特点。 (2)在小鼠小胶质细胞株BV2细胞,HAMI3379可抑制OGD/R诱导BV2细胞适度激活后的炎症因子合成及释放的增加以及吞噬功能、细胞自噬的增强。普鲁司特有相似的作用,但不影响吞噬功能。HAMI3379可抑制OGD/R诱导的CysLT1R-CysLT2R相互作用以及细胞内移动变化,且可增强CysLT1R表达上调。 (3)首次较系统地证实CysLT2R拮抗剂抗脑缺血作用,进一步证实了HAMI3379通过抑制CysLT2R介导的小胶质细胞激活,为其临床应用提供了实验依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

【参考文献】