以促内涵体逃逸聚合物为载体构建脑靶向基因传递系统沉默BACE1基因的研究

发布时间：2019-03-08 08:04

【摘要】：中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)疾病，包括神经退行性疾病及脑部肿瘤等，严重危害人类健康。许多神经退行性病变与基因的异常表达有关，基因药物具有分子靶点的高特异性特点。因此，针对CNS疾病治疗，高效、准确的靶基因沉默技术具有很好的治疗前景。但是，由于血脑屏障（the blood brain barrier，BBB）的生理作用，包括基因药物在内的大多数大分子药物无法主动转运跨越BBB至脑内，实现其有效治疗作用。因此，构建通过非侵袭给药途径如鞘内注射，将基因药物传递入脑的药物载体系统至关重要。经载体的包封，可以有效降低血液中核酸酶的影响从而提高药物稳定性。此外，特异性配体修饰的非病毒载体，可通过静脉给药途径实现载药系统主动转运透过BBB，将药物递送至脑内。基于以上研究背景，本课题构建了一种新型的阳离子聚合物PEG-P[Asp(TEP)]-chole作为基因载体，制备PEG-P[Asp(TEP)]-chole/pDNA聚阳离子复合物（Polyplxe）。由于天冬氨酸为构成体内蛋白的基本氨基酸，所以生物相容性较好，载体的安全性得到提高。进而在聚阳离子复合物表面修饰了双级靶向配体，由狂犬病毒糖蛋白衍生的多肽RVG29作为一级脑靶向配体，与BBB上的乙酰胆碱受体和γ-氨基丁酸受体特异性结合结合，以受体介导的内吞作用，实现主动靶向脑转运。由Tet-1肽作为二级靶向配体与神经节苷脂GT1B受体特异性结合靶向于神经细胞。第一部分，阳离子聚合物载体的合成及表征。合成L-天冬氨酸-N-羧酸酐（BLA-NCA）单体，以BLA-NCA和聚乙二醇为原料合成PEG-PBLA嵌段聚合物。然后，对聚天冬氨酸链端进行氨基修饰，使PEG-PBLA呈正电性，可与带负电的基因压缩形成纳米聚阳离子复合物。进一步将聚合物进行胆甾醇修饰，得到PEG-P[Asp(TEP)]-chole，聚合物的疏水性增加，有利于粒子的生物膜的透过性能及稳定性提高。配体的连接利用乙缩醛与多肽结构中半胱氨酸的巯基反应。在醋酸缓冲液为介质的酸性环境中，PEG末端的乙缩醛基水解为醛基，与含有半胱氨酸的多肽Tet1或RVG29反应，得到经配体修饰的聚合物Tet1-PEG-P[Asp(TEP)]-chole或者RVG29-PEG-P[Asp(TEP)]-chole。通过核磁氢谱进行结构分析，结果显示，合成的终产物为PEG-P[Asp(TEP)]-chole，并且将多肽Tet1和RVG29修饰于PEG-P[Asp(TEP)]-chole之上。第二部分，聚离子基因复合物的制备及表征。制备不同N/P比的载重组质粒复合物，测定其粒径、Zeta电位并通过凝胶电泳考察其基因复合能力。结果显示，随N/P的增加，粒径逐渐减小，至150nm以下，当N/P比为12以上时，粒径约100nm，有利于聚阳离子复合物透过BBB。Zeta电位结果显示，随N/P的增加，正电性逐渐增加，N/P比等于16时，Zeta电位约+15mV。凝胶电泳显示，随N/P比的增加，游离pDNA的条带逐渐变浅，N/P比12时，条带完全消失。说明随着表面的正电荷逐渐增加，载体对pDNA的包封能力逐渐提高，而正电性的提高既有利于透过BBB（BBB内皮细胞带负电性），此外能够提高转染效率。第三部分，聚离子基因复合物的细胞及组织毒性考察。采用MTT法，以常用的转染试剂Lipofectamin-2000为阳性对照考察不同N/P比的聚阳离子复合物对bEnd.3细胞和Neuro-2a细胞的毒性。结果显示，不同N/P制备的复合物给药后，两种细胞生存率均在85%以上，而Lipofectamin-2000对照组的细胞生存率小于80%。结果表明，与lipofectamine-2000相比，PEG-P[Asp (TEP)]-chole具有较小的细胞毒性。CD68免疫组化考察PEG-P[Asp (TEP)]-chole的组织毒性。Balb/c小鼠尾静脉给药7d后，分别于24h和72h观察主要器官中阳性细胞数量。结果显示，给药24h后肾脏、肺、脾有少量的炎性细胞，其它组织与生理盐水组相比，无显著性差异。72h结果显示，各组织中几乎无阳性细胞，与生理盐水组无显著性差异。CD68免疫组化结果表明，PEG-P[Asp (TEP)]-chole对部分组织有一定的急性毒性，随着时间延长可趋于正常。第四部分，聚离子基因复合物的促内涵体逃逸及脑转运特性考察。通过细胞摄取、细胞内定位示踪、跨细胞单层膜培养实验评价基因递药系统的双级脑靶向特性。将Cy3标记的pDNA包载于阳离子聚合物中，与bEnd.3细胞共孵育，结果显示，RVG29/Tet1-polyplex能被bEnd.3细胞特异性摄取。流式细胞仪定量检测不同配体修饰的polyplex，结果显示，经RVG29修饰后细胞摄取率提高了19.3%。Neuro-2a细胞内定位示踪实验表明，polyplex被摄取进入神经细胞，定位于细胞核周围，随孵育时间的增加，polyplex能够成功从内涵体中逃逸出来，进而实现基因的转染。将pGFP和pGL3质粒分别包载于阳离子聚合物中，分别用于定性、定量分析。转染定量结果显示，Tet1-polyplex组转染效率是未修饰组的3.3倍，双配体修饰组在细胞中表现出最强的荧光强度，是未修饰组转染效率的4.6倍。将bEnd.3和Neuro-2a共培养于细胞小室Transwell中，模拟BBB屏障，跨单层膜转运实验表明，Tet1/RVG29-polyplex相对于修饰单配体RVG29或者Tet-1能跨过转运透过bEnd.3细胞单层膜，，靶向于Neuro-2a细胞，增加其摄取， Tet1/RVG29-polyplex的透膜率约是未修饰组的2倍。采用小动物活体成像技术，评价所构建载体系统的体内分布，将荧光染料DiR包裹于不同配体修饰的PEG-P[Asp (TEP)]-chole，尾静脉注射后，于一定时间点动物活体成像仪观察体内荧光分布。结果表明，双配体修饰的复合物相对于未修饰及分别修饰单配体的聚阳离子复合物具有更多的脑内分布，说明其实现了双级靶向性，增加药物的脑部转运。第五部分，聚离子基因复合物沉默BACE1基因。通过将干扰RNA构建于质粒，将具有干扰作用的质粒包载于双配体Tet1和RVG29修饰的阳离子聚合物载体中，能有效下调神经细胞Neuro-2a中的BACE1蛋白水平。双转基因APP/PS1AD小鼠，尾静脉注射polyplex后，Morris水迷宫评价小鼠的空间记忆能力，结果表明，polyplex经Tet1和RVG29多肽修饰后，小鼠的空间记忆能力显著提高，说明polyplex-Tet1/RVG29是一种更为有效的脑内递药系统。本课题合成了一种新型阳离子聚合物，将siRNA重组质粒复合其中，并进行了双配体的修饰，构建了一种具有脑部基因传递作用的聚阳离子复合物，实验结果显示，该载体系统具有良好的脑靶向性，且毒性较低，是一种有潜力的非病毒基因载体。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】