肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）偶联物的设计及其特异性抗肿瘤作用研究

发布时间：2019-03-29 20:49

【摘要】：1. TRAIL-NC1和TRAIL-TD融合蛋白的设计与复性 肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族的一员,由于其能选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无害而被视为有潜力的抗肿瘤蛋白药物。TRAIL能通过与肿瘤细胞细胞表面的死亡受体结合,从胞外途径传递死亡信号,最终诱导细胞凋亡。然而,目前常见的一些重组TRAIL均存在同样的问题：不稳定和半衰期短。 为了克服这些问题,研究者们制备了许多带标签的重组TRAIL融合蛋白,如His-TRAIL, Flag-TRAIL, LZ-TRAIL和iLZ-TRAIL,旨在增强TRAIL的稳定性和活性,另外也是为了纯化方便的考虑。遗憾的是,虽然这些TRAIL融合蛋白表现出极强的肿瘤细胞诱导凋亡能力,同时却也引起了肝毒性。由于带有外源标签的TRAIL同时带有毒副作用,因此有研究者采用内源的融合片段(human pulmonary surfactant-associated protein D)来制备具有双重功能和更高凋亡活性的TRAIL融合蛋白。综上,寻找内源性双功能片段作为TRAIL的融合伴侣,有望解决TRAIL半衰期短、稳定性差和肝毒性等缺点。 在本章节中,我们利用来源于人胶原蛋白ⅩⅤⅢ的NC1和NC1中的三聚域(TD),设计了两种全新的TRAIL融合蛋白：TRAIL-NC1和TRAIL-TD,并且在大肠杆菌表达系统成功表达。由于两种融合蛋白都以不溶的包涵体形式存在于大肠杆菌中,且传统的复性方法难以对它们进行成功复性,因此我们开发了新的复性方法——两步复性法,它结合了稀释复性和凝胶过滤法柱上复性的优点,分步复性融合蛋白,最终成功复性了TRAIL-NC1融合蛋白。 分子排阻色谱分析TRAIL-NC1融合蛋白表明它的存在形式为三聚体,而TRAIL-TD融合蛋白为六聚体。TRAIL-NCI融合蛋白的诱导肿瘤细胞凋亡活性与同样方法复性后的TRAIL (114-281)相同,然而大大弱于可溶性的TRAIL(114-281)(活性强50倍左右),仍未满足最初设计TRAIL-NC1的要求。因此,本章节最主要的贡献为开发了新的两步复性法,丰富了蛋白质复性领域的方法,对于TRAIL存在的缺点,仍需继续设计不同的解决方案。 2. TRAIL-vcMMAE的设计与抗肿瘤活性研究 TRAIL三聚体通过与细胞表面的死亡受体DR4和DR5结合传递死亡信号,从而诱导细胞凋亡。诱捕受体(DcR1和DcR2)和可溶性受体(OPG)由于只含有部分或不含死亡域(death domain, DD)而不能传递TRAIL的凋亡信号。然而,仍然存在一些肿瘤细胞,其细胞表面表达DR4和DR5,却仍然对TRAIL耐受,比如许多乳腺癌细胞系和黑色素瘤细胞系。研究者们认为细胞内TRAIL信号通路上一些事件导致了上述现象,例如FADD和caspase8存在缺陷、cFLIP过表达等原因。TRAIL可以通过与死亡受体结合被细胞内吞,同时该内吞行为并不是TRAIL诱导凋亡所必需的。因此,为了克服表面表达有DR4和DR5死亡受体的肿瘤细胞对TRAIL的耐受性,我们利用这一内吞过程来使TRAIL通过化学偶联携带剧毒小分子药物进入细胞内,细胞内溶酶体中的多种蛋白酶能够水解偶联物从而释放出剧毒小分子,以另外的途径诱导细胞凋亡。 我们选择了海兔毒素衍生物MMAE用于偶联TRAIL,它们通过一个二肽(valine-citrulline,vc) linker相连接。MMAE是一种人工合成的有丝分裂抑制剂,它能通过抑制微管蛋白二聚化阻滞细胞分裂,从而使细胞凋亡。vcMMAE是一个在细胞外稳定的系统,而当它进入细胞后,可经溶酶体中组织蛋白酶B的水解,释放出MMAE,发挥抑制有丝分裂的机制。 在本章的研究中,我们设计了两种TRAIL(95-281)突变体(S96C和N109C)用于偶联vcMMAE,并且从体外活性实验中选出活性更优的N109C-vcMMAE进行后续的研究。后续的实验表明N109C-vcMMAE在肿瘤细胞摄取、死亡受体亲和力、内吞、体内靶向等方面有良好的表现,初步证实了TRAIL-MMAE偶联物在抗肿瘤方面的可行性,进而拓宽了抗体偶联药物(ADC)的覆盖范围,使TRAIL能够替代抗体成为ADC中的“靶向弹头”部分。 3.一种突变Cys位点特异性PEG修饰TRAIL的方法及其产物的抗肿瘤活性研究 在小鼠肿瘤移植模型中,无论是TRAIL单独用药还是与化疗药物联用,都展现出显著的抗肿瘤效果。然而,在2011年,Amgen和Genentech先后将TRAIL(产品名：Dulanermin)从公司产品线上撤下,且未发布具体缘由。可推测的是TRAIL本身的一些缺点制约了其在临床上的进一步进展,比如：半衰期短、稳定性差和潜在肝毒性。Polyethylene glycol (PEG)是一种生物相容性极佳的高分子聚合物,PEG修饰也被公认为是最成功的蛋白修饰方式之一,经过PEG修饰的蛋白具有更长的半衰期、更好的稳定性以及更低的免疫原性。美国食品药物监督管理局(American Food and Drug Administration, FDA)至今已批准了诸多经PEG修饰的蛋白药物和酶类,比如,用于治疗急性淋巴细胞白血病和其他淋巴瘤的PEG-天冬酰胺酶(商品名：Oncaspar),用于治疗急性联合免疫缺陷症的PEG腺苷脱氨酶(商品名：Adagen)。因此,研究者利用PEG修饰来改善TRAIL的药代动力学特性和稳定性也就是意料之中的事情了。由于N端的氨基比侧链氨基残基具有更小的pKa值,只要控制反应条件就能实现特异性地跟N端氨基的反应,因此之前的研究者们均采用N端特异性PEG修饰的方法。但是该方法所需时间较长、效率较低,因此需要我们找到一种更为简便、高效的PEG修饰TRAIL的方式。 在本章中,我们描述了一种新型PEG-TRAIL的制备、分析和活性评价过程,它为在突变Cys位点进行PEG修饰的TRAIL (95-281)突变体。我们选择单甲基化聚(乙二醇)马来酰亚胺(mPEG-MAL)用于修饰TRAIL,因为马来酰亚胺基团能快速与TRAIL突变体上还原后的半胱氨酸巯基(Cys-SH)反应生成硫醚键。我们选择N109C作为反应的TRAIL(95-281)突变体,原因在于N109C突变了一个潜在的N-糖基化位点(Asn-109)且在第三章中成功偶联了MMAE,并展现出很好的抗肿瘤活性。在本章的研究中,我们在突变Cys-SH定点PEG修饰TRAIL(95-281)突变体N109C (mPEGMAL-N109C)的体内外活性、稳定性、药代动力学性质等方面进行了深入研究。同时,我们构建了N-端直接特异性PEG修饰的TRAIL(114-281)(mPEGALD-TRAIL114-281),用于与mPEGMAL-N109C比较,作为传统PEG定点修饰方式的对照。结果显示,相比野生型TRAIL(114-281)和mPEGALD-TRAIL114-281,mPEGMAL-N109C表现出更高的体内抗肿瘤活性、更好的稳定性、更长的半衰期,同时没有检测到任何的肝肾毒性,表明突变Cys位点的特异性PEG修饰可以成为修饰TRAIL一种更好选择。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R91;R96
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本文编号：2449873