微生物来源的缩肽类先导化合物Enopeptin的研究

发布时间：2019-03-30 20:15

【摘要】：细菌耐药性已经成为全球性问题,人类面临“后抗生素时代”威胁。缩酚酸肽化合物是一类包含酯键的多肽,是由羟基酸和氨基酸由酯键和酰胺键连接构成的一类寡聚物。具有抗菌、抗病毒、抗血栓、抗虫以及抗肿瘤等多种生物活性。其中酰基缩酚酸肽(α-cyldepsipetide,ADEP)作为一种新型抗菌肽,对耐药菌有其独特的抗性机制,其作用靶点是高度保守的细菌酪蛋白水解激酶(caseinolytic kinase,Clp P),ADEP通过结合Clp P,使细菌蛋白质水解不受调控,最终导致细菌死亡。Enopeptin A为ADEP家族的一员,具有抗病毒和抗包括耐甲氧西林-金黄色葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌以及细胞膜缺陷的革兰氏阴性突变体。近年来,科学家通过化学合成的方法对Enopeptin进行结构修饰,获得的衍生物抗耐药菌活性得到大幅提升。本文通过对Enopeptin A发酵及分离纯化工艺的研究,为该品种进行后续的结构修饰改造、构效关系的研究、以及新衍生物的开发奠定基础,以期最终获得具有抗病毒和抗耐药菌双重效果的新药物。本课题对化合物Enopeptin A的研究与开发具有一定的原创性和实用价值。论文针对目标产物Enopeptin A建立了紫外-可见分光光度含量分析检测法及HPLC分析检测法。紫外-可见分光光度法的检测波长为375 nm;HPLC的色谱条件为:色谱柱:Hypersil ODS2(250×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-1‰甲酸水(50:50);流速:1.0 m L/min;检测波长:375 nm;柱温:40℃;进样量20μL。原始菌株SIIA-H7264(110μg/m L)通过紫外线、NTG、EMS以及常压室温等离子体等理化诱变选育,得到高产稳定的突变株A-21(440μg/m L)。设计优化了种子工艺、发酵控制条件,并经单因素筛选及响应面法试验,获得最适发酵培养基配方,其组成为:葡萄糖2%,糊精8.85%,黄豆粉3%,硝酸钾0.74%,氯化钠0.2%,磷酸二氢钾0.1%,碳酸钙0.2%,p H 7.5。最佳发酵条件:接种量3%,培养温度28℃,250 m L摇瓶培养基装量为20 m L,摇床转速220 r/min,发酵周期138h。在该条件下,Enopeptin A的产量达到1750μg/m L,相较于对照发酵产量440μg/m L,提高了2.98倍,比文献报道的Enopeptin A的产量150μg/m L提高了10.67倍。对Enopeptin A的分离纯化工艺进行了研究开发,通过溶媒萃取及层析工艺,包括填料、层析系统等参数的研究,最终确定发酵液滤液和菌丝体分别采用大孔吸附树脂层析及溶媒萃取进行Enopeptin A的粗制分离,后结合正相硅胶和反相硅胶多步层析的精制工艺路线,该提取工艺成本较低,并有效减少了有毒有机溶剂的使用,最终获得的Enopeptin A产品HPLC纯度达到95.0%以上,提取总收率达44%,开发了一条适宜于样品放大制备的提取工艺路线。
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【学位授予单位】：成都学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R915

【参考文献】