海洋天然产物Stellettin B对CML细胞的抗肿瘤作用及分子机理

发布时间：2019-04-09 09:47

【摘要】：目的:本文旨在探讨研究Jaspis stellifera海绵来源的三萜类化合物Stellettin B(Stel B)对人慢性粒细胞白血病(CML)细胞的体外抗癌活性及分子机理,为此类药物的研发及用于慢性粒细胞白血病治疗提供一定的理论依据与指导。方法:1.利用WST-8实验检测Stel B对K562、KU812细胞的增殖抑制作用;从中选取对药物较敏感的细胞系(K562细胞),进一步采用软琼脂克隆形成实验评价Stel B的细胞增殖抑制活性。2.在药物联合应用研究中,利用MTT实验检测Stel B单用或与Imatinib联合用药对K562细胞的增殖抑制活性,计算药物IC50值,分析其药效协同作用。3.利用流式细胞仪检测Stel B对细胞周期、细胞凋亡、细胞内ROS及线粒体膜电位的影响。4.利用Western blot检测浓度梯度Stel B处理K562细胞前后,细胞中凋亡相关蛋白因子的表达水平变化;利用Western blot检测Stel B处理K562细胞前后,细胞中PI3K/Akt通路中相关分子表达或磷酸化水平变化。5.利用siRNA方法降表达Stat5后,采用Western blot检测Stel B对K562细胞中Stat5信号通路和PI3K/Akt信号通路关键分子表达或磷酸化水平的影响。6.应用Chou and Talalay’s方法研究Stel B与Imatinib联合应用,借助Calcu Syn软件计算Fa-CI值,分析两药联合是否具有协同药效。结果:1.Stel B具有抑制CML细胞增殖活性。WST-8实验结果显示,Stel B呈剂量依赖性方式抑制K562,KU812细胞增殖,药物IC50值分别为0.035,0.95μM;Stel B对健康人外周血单个核细胞(PBMC)显示较低细胞毒作用,其IC50值大于39μM。选取CML K562细胞进行软琼脂克隆形成实验的结果显示,Stel B给药组的细胞克隆形成率及单个克隆大小均小于对照组,进一步证明Stel B具有抑制CML K562细胞增殖活性。2.Stel B对K562细胞未见明显的细胞周期阻滞作用。3.Stel B具有诱导K562细胞凋亡活性。Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪分析显示,Stel B处理组的凋亡细胞数目(7.5%、22.44%、26.1%、32.2%、44.6%)较对照组(5.41%)显著提高;Stel B处理组中凋亡相关蛋白Bad,Bax表达增加,Bcl-2表达降低,Caspase-9、Caspase-3、PARP的裂解片段增加。Stel B诱导K562细胞内ROS水平增加,线粒体膜电位水平降低,且呈剂量依赖性。4.Western blot结果显示Stel B可显著降低K562细胞中PI3K 4种催化亚基和调节亚基PI3K-p85的表达水平。此外,可降低Stat5、PDK1、Akt、m TOR和p70S6K蛋白磷酸化水平。分别应用小分子抑制剂SH-4-54和si RNA抑制Stat5的表达和活性,并采用Western blot检测了PI3K的表达水平和PDK1、Akt的磷酸化水平。实验结果显示,沉默或抑制细胞内Stat5后,PI3K催化亚基p110α、p110β、p110γ、p110δ和调节亚基p85的表达水平均有不同程度的降低,其中p110β的降表达最为显著;PDK1、Akt的磷酸化水平也明显降低。当进一步引入Stel B干预后,PI3K-p110β、p85的表达和PDK1、Akt的磷酸化水平降低更为显著,说明Stel B抑制K562细胞增殖、诱导凋亡的活性可能是通过调控Stat5和PI3K/Akt通路实现的,且Stat5和PI3K/Akt通路存在一定的相关性。5.应用Chou and Talalay’s方法研究Stel B与Imatinib联合应用,结果显示当采用IC50 Stel B?5×IC50 Imatinib药物浓度比时,Stel B与Imatinib联合用药指数CI值1,说明药物联合具有协同药效。软琼脂克隆形成实验结果表明联合用药组较药物单用组形成的克隆大小及克隆数均显著降低。利用流式细胞仪检测细胞凋亡作用,结果显示Stel B与Imatinib联合应用对K562细胞的凋亡作用更强。通过检测凋亡相关蛋白发现联合应用后Caspase-3,PARP的裂解片段明显增加。以上结果说明药物联合应用组抑制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡活性均强于药物单用组,显示出协同药效。结论:1.Stel B体外抗CML作用主要体现在对K562细胞的抑制增殖、诱导凋亡活性,其分子作用机制可能是通过调控Stat5和PI3K/Akt信号通路实现的。本实验首次阐明了海洋来源天然产物Stel B对CML的体外抗肿瘤作用及分子机制。2.Stel B与Imatinib联合应用在IC50 Stel B?5×IC50 Imatinib的用药浓度比例下显示出协同药效,该协同作用主要体现在抑制细胞增殖、诱导凋亡两个方面。实验结果为Stel B类药物的研发及用于治疗CML提供了初步理论依据和实验基础。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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