细胞外囊泡的生物学功能及其作为体内小核糖核酸药物递送载体的研究

发布时间：2019-05-09 20:11

【摘要】：细胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)是一种由细胞分泌的直径在30-100nm之间的双层膜包被的囊泡,通常也被称为微囊泡(Microvesicle, MV)或外泌体(Exosome)。EV通过介导细胞间的信号交流参与到很多生理过程及病理过程中。研究表明,细胞分泌的EV中包含miRNA,这些miRNA可以被运送至受体细胞并通过改变靶基因的表达调控受体细胞的功能。因此,越来越多的研究开始关注EV是否能够成为一种有效的体内核酸药物递送载体。为了从理论上确定细胞分泌的EV具备作为药物运送载体的可能性,我们首先对细胞分泌的EV的生物及物理性质做了分析。人胚肾细胞293T细胞系是目前常用的一种体外包裹分泌小核糖核酸的细胞系,因此我们首先对293T细胞的EV作为药物运送载体的可能性进行了分析。首先我们对293T细胞来源的外泌体中蛋白质,mRNA和miRNA的表达谱进行了鉴定。然后我们对这些数据进行了基因本体(GO)分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。生物信息学的分析结果表明293T细胞来源的外泌体中蛋白质,mRNA和miRNA组成不会显著影响受体细胞的生物学功能,也没有明显的组织特异性。我们定量对比分析了293T细胞转染功能性小RNA分子是否会改变外泌体蛋白质的表达,实验结果表明转染功能性小RNA分子基本不会影响293T来源的外泌体的蛋白表达水平。我们的研究结果从理论上表明293T来源的外泌体适合作为一种体内药物递送载体。在此基础上,我们开始对EV作为药物载体的可行性进行研究。我们发现肿瘤个体内,EV包裹的miR-150可以被递送至肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过上调其表达血管内皮生长因子(VEGF)从而促进肿瘤的生长。这一现象说明miR-150在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。为了证实miR-150可以作为肿瘤治疗的靶点,我们对体内miR-150的水平进行干预并观察小鼠肿瘤生长情况。在治疗过程中,我们制备包裹着miR-150反义序列的293T EV并对植瘤小鼠进行尾静脉注射。结果显示,EV包裹的miR-150反义序列(anti-miR-150)可以有效降低循环系统和肿瘤中miR-150和VEGF的表达水平,从而通过抑制肿瘤的血管新生抑制了肿瘤的生长。综上所述,我们不仅发现了miR-150在肿瘤生长过程中的作用,同时还提出了一种潜在的治疗癌症的新方法,即通过注射EV包裹的反义RNA序列来降低关键miRNA的表达从而达到治疗肿瘤的效果。为了进一步证实EV做为核酸药物体内运送载体的可能性,我们利用EV包裹siRNA来治疗阿片类药物的成瘾。在这一部分实验中,我们通过基因工程手段在EV表面表达了乙酰胆碱受体的肽段RVG,使得改造后的EV获得穿过血脑屏障、特异性到达中枢神经系统的能力。利用这种改造过的EV,我们有效的将介导阿片成瘾的关键蛋白OPRM的siRNA运送至脑中。结果显示RVG修饰的包裹的siRNA的EV可以有效降低小鼠脑中OPRM的蛋白质和mRNA的表达水平,并且在成瘾小鼠模型中强烈抑制了成瘾小鼠的复吸行为。我们的实验结果提供了一种治疗毒品成瘾复吸的新策略。综上所述,细胞分泌的EV可以作为一种有效的药物运送载体。并且和其他已知的药物运送载体相比,它具有毒性小、无免疫排斥等优势。目前基于siRNA等手段的基因治疗成为一种很有潜力的治疗方式,但是siRNA的运送问题一直是制约siRNA治疗的瓶颈。我们的发现为siRNA药物递送提供了新的思路,并且通过改造EV,可以使EV具有靶向性,更有效更特异的进行靶向治疗。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943

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本文编号：2473054