PI3K抑制剂ZSTK474抗白血病的作用及机理研究

发布时间：2019-05-11 04:37

【摘要】：目的:本实验以人髓系白血病细胞系K562、HL60及其耐药细胞系K562/A02和HL60/ADR为体外研究模型,探讨PI3K抑制剂ZSTK474对人白血病细胞的抗肿瘤作用和分子机理,并在此基础上,进一步探讨了ZSTK474与白血病化疗药物的联合应用以及ZSTK474的逆转耐药机制。本文首次系统报道了ZSTK474单用及与化疗药物联合用药对急性、慢性白血病的体外治疗作用,为PI3K抑制剂类新型抗白血病药物的开发及应用于治疗白血病提供了理论依据和初步实验基础。本文分为三个部分:第一部分为ZSTK474体外抗白血病活性研究;第二部分为ZSTK474与白血病化疗药物的联合用药研究;第三部分为ZSTK474逆转耐药性机制研究。方法:1、利用MTT法、软琼脂克隆形成实验检测ZSTK474对K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞的抗增殖活性。2、利用流式细胞术检测ZSTK474对K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞周期分布、凋亡的影响。3、采用western-blot检测ZSTK474对K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞周期相关蛋白cyclinD1、p27、pRb等因子表达及磷酸化水平的影响。同时还采用该法检测了ZSTK474干预前后细胞中PI3K/Akt信号通路关键因子PDK-1、Akt、GSK-3β的磷酸化水平。4、采用qRT-PCR法检测了ZSTK474对K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞中p27 mRNA表达水平的影响。5、采用Chou-Talalay法结合CalcuSyn软件分析了ZSTK474与不同化疗药物联合应用后的药物联合系数(combination index,CI),进行联合用药效果评价。6、通过检测底物蓄积,如ADR蓄积和5-CFDA外排,评价ZSTK474对K562/A02和HL60/ADR细胞中耐药蛋白MDR1和MRP1功能的影响;采用western-blot法研究了ZSTK474干预前后两种耐药细胞中耐药蛋白MDR1和MRP1表达水平变化。结果:1、MTT实验结果显示ZSTK474能够剂量依赖性地抑制K562、HL60及其耐药细胞K562/A02、HL60/ADR的细胞增殖,其IC50值分别为4.69μM(K562)、1.165μM(HL60)、7.57μM(K562/A02)、1.160μM(HL60/ADR)。软琼脂克隆形成实验结果也显示ZSTK474能够抑制K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR四种细胞的增殖能力,主要表现在克隆数量和克隆形成率均随着给药剂量增高而降低。2、PI染色、流式细胞术分析结果显示ZSTK474干预K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞后,四种细胞均发生细胞周期G1期阻滞;Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术分析结果显示,ZSTK474干预后四种细胞均未见显著性细胞凋亡现象。3、Western-blot检测细胞周期相关蛋白表达及磷酸化水平的结果显示,ZSTK474处理K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞后,在四种细胞中,p27呈现升表达,cyclinD1呈现降表达,pRb发生去磷酸化;Western-blot检测PI3K/Akt信号通路关键因子水平的结果显示,ZSTK474干预四种细胞后,细胞PDK-1、Akt、GSK-3β的磷酸化水平均下降。4、qRT-PCR结果显示,ZSTK474处理K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞后,细胞中p27的mRNA水平升高。5、联合用药结果显示,对于K562和K562/A02细胞,ZSTK474与Imatinib联合用药在ED50、ED75、ED90下的CI分别为0.37,0.39,0.54和0.08,016,0.39;对于HL60和HL60/ADR细胞,ZSTK474与阿糖胞苷联合用药在ED50、ED75、ED90下的CI分别为0.73,0.35,0.24和0.42,0.64,1.17。ZSTK474与长春新碱联合用药在ED50、ED75、ED90下的CI分别为0.76,1.08,1.67和0.25,0.70,2.03。ZSTK474与高三尖杉酯碱联合用药在ED50、ED75、ED90下的CI分别为0.68,0.57,0.67和0.96,1.62,2.75。6、ZSTK474处理K562/A02、HL60/ADR细胞后,底物蓄积检测结果显示,两种细胞中ADR发生明显蓄积,HL60/ADR细胞中5-CFDA发生明显蓄积;western-blot检测结果显示,两种细胞中MDR1的表达水平呈现ZSTK474剂量依赖性降低,在HL60/ADR细胞中MRP1的表达也呈现ZSTK474剂量依赖性降低,而在K562/A02细胞中未检测到MRP1表达。结论:1、ZSTK474能够抑制K562、HL60及其耐药细胞K562/A02、HL60/ADR的增殖、将四种细胞周期阻滞在G1期,且该活性可能是通过调控PI3K/Akt信号通路实现的。2、ZSTK474与本实验中使用的抗白血病化疗药物联用在K562、HL60、K562/A02、HL60/ADR细胞中在ED50下均显示协同药效。3、ZSTK474可能是通过影响K562/A02、HL60/ADR细胞耐药蛋白MDR1和/或MRP1的表达水平和功能,从而表现出逆转耐药活性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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本文编号：2474248