低分子量硫酸软骨素的制备、抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究

发布时间：2019-05-30 17:08

【摘要】：研究目的骨性关节炎(osteoarthritis,OA)的发病机理非常复杂,现在的研究表明补体系统在OA的发病过程中发挥着重要的作用,而补体系统的替代途径在OA中又占据主要位置。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是由D-葡糖醛酸残基和N-乙酰-D-半乳糖胺残基组成的双糖单位线性连接组成的一类糖胺聚糖,大量的研究表明其具有缓解、治疗OA的生物学功能。其中低分子量硫酸软骨素(1owmolecular weight chondroitin sulfate,LMWCS)在缓解、治疗OA方面效果更加明显。但是1MWCSs通过与补体系统相互作用起到防治OA的作用目前尚未有研究。同时LMWCSs由于来源不同、制备工艺不同等导致其具有不同的生物活性,探讨LMWCS s与抗补体活性的构效关系,阐明LMWCSs的结构对补体活性的影响,将对LMWCSs防治OA奠定一定的理论基础,同时对LMWCSs的生产具有指导意义。为了探讨CS抗补体作用与其结构的关系及抗补体作用在其防治OA中发挥的作用,本研究采用4种不同的降解方法对3种不同来源的CS进行降解得到一系歹LMWCSs,然后对这些LMWCSs的抗补体活性进行评价,研究LMWCSs结构与抑制补体替代途径活性之间的构效关系,并选出一种抗补体活性较高的LMWCS。通过对活性较高的LMWCS的体内、体外的活性评价,证明其抗补体活性与其防治OA的关系。最后,针对于目前筛选CS的抗补体活性的方法存在费时、费力的问题,通过利用近红外光谱分析技术建立一种快速无损的高通量筛选CS抗补体活性的方法。研究方法1 LMWCSs的制备及表征本研究拟采用氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波辅助碱降解法对鲨鱼来源、猪来源和牛来源的CS进行降解得到不同的LMWCSs。采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)、紫外可见光谱法、分子排阻色谱-多角度激光散射法(size exclusion chromatography-multi angle light scattering, SEC-MALLS)、核磁(ruclear magnetic resonance,NMR)等方法对LMWCSs的性质进行表征和研究。2不同LMWCSs的抗补体活性研究与构效关系分析采用溶血法测定LMWCSs抑制替代途径活性的IC50值,通过利用性质的表征结果对LMWCSs的结构和LMWCSs的抗补体活性之间的构效关系进行研究,分析其构效关系,进而选择出一种具有较好的抗补体活性的LMWCS用于进一步的体内外活性研究。3LMWCS对软骨细胞的影响体外研究采用酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的方法研究LMWCS对补体替代途径激活过程中补体蛋白3(complement 3,C3)沉积的影响；采用补体介导的软骨细胞死亡的方法研究LMWCS通过抑制补体活性保护软骨细胞的作用；采用RT-PCR的方法研究替代途径激活的情况下,LMWCS对软骨细胞C3 mRNA水平的影响。4 LMWCS对实验性骨性关节炎的影响研究通过采用小鼠内侧半月板不稳定(destabilization of the medial meniscus,DMM)的方法诱导建立OA模型。考察LMWCS通过口服给药调节补体系统缓解、治疗OA的情况。利用测定小鼠后腿支撑力差值的方法考察小鼠OA的疼痛程度；利用番红固绿染色对LMWCS缓解OA的程度进行分析；利用ELISA和免疫组化的方法分别检测小鼠体内C5b-9的含量水平以及小鼠关节软骨的C5b-9的含量。5基于近红外光谱分析技术的CS抗补体活性筛选方法的建立收集不同来源、不同相对分子质量(Mr)的CS样品。采用漫反射的方式采集近红外光谱,利用溶血法测定样品抑制替代途径补体活性的IC50。通过利用因子实验设计的方法优选最佳预处理方法,利用无信息变量消除(uninformativevariable elimination, UVE),竞争自适应加权采样(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)和随机蛙跳(rondom frog)的方法选择有效信息建立偏最小二乘(partial least square,PLS)回归模型,采用预测集均方根误差(root-mean-squares error of prediction,RMSEP)、相对分析误差(residual predictive deviation,RPD)等参数对模型的预测能力进行评价。研究结果1 LMWCSs的制备及表征采取氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波辅助碱降解法对鲨鱼来源、猪来源和牛来源的CS进行降解共获得12种LMWCSs。FTIR结果显示LMWCSs和CS的骨架结构一致；采用HPLC进行双糖分析,结果表明不同来源的双糖组成不同,同种来源的CS和LMWCS组成相同,不同的降解方法对硫酸根的损失不同,酸降解和微波辅助碱降解的硫酸根丢失严重,氧化降解和酶降解对硫酸根含量影响不大；采用紫外分析表明酶解法产生的LMWCSs含有不饱和糖醛酸结构；NMR结果表明酶降解法的LMWCSs的非还原端产生了不饱和糖醛酸,而其它LMWCSs的非还原端结构与未降解的CS一致；分子排阻色谱-多角度激光散射测定LMWCSs的重均相对分子质量(厨w)的结果表明,通过利用不同的方法制备了厨w在1217 Da到8085 Da的LMWCSs.2不同LMWCSs的抗补体活性研究与构效关系对LMWCSs的结构和活性之间的关系进行研究。结果表明,利用鲨鱼来源的CS采用氧化降解的方法制备的LMWCS(LMWCS-S-O)具有更好的抗补体活性。对于LMWCSs与抗补体活性进行构效分析表明：△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S双糖结构有利于提高LMWCS的抗补体活性,而△Di-6S和△Di-OS不利于提高抗补体活性。LMWCS-S-O在缓解、治疗OA中可能具有更好的疗效。并且选择出具有较好活性的LMWCS-S-O和较低活性的猪来源CS(CS-P)进行进一步的活性研究。3 LMWCS对软骨细胞的影响采用ELISA的方法研究LMWC S对补体替代途径激活过程中C3沉积的结果表明,LMWCS-S-O在400 μg/mL时可以显著性地抑制C3b的产生,从而抑制替代途径激活。而猪来源CS(CS-P)在1.2mg/mL时才显著性的抑制替代途径；对提取的软骨细胞进行形态学和阿利新蓝染色结果表明软骨细胞提取正确；MTT实验表明在500 μg/mL的浓度下,LMWCS-S-O和CS-P对软骨细胞并没有毒性；补体介导的软骨细胞死亡的实验结果表明400 μg/mL的LMWCS-S-O可以显著性地抑制补体活性保护软骨细胞；RT-PCR的结果表明,LMWCS-S-O可以显著性地抑制由脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的软骨细胞C3mRNA水平,从而抑制软骨细胞的C3表达水平。4 LMWCS对实验性骨性关节炎的影响通过利用DMM的方法成功的建立了小鼠OA模型；小鼠支撑力结果表明LMWCS-S-O可以显著性地缓解OA带来的疼痛。番红固绿染色结果表明LMWCS-S-O可以减少小鼠骨关节表面软骨的损失,缓解OA的进程；ELISA和免疫组化的结果表明LMWCS-S-O可以抑制C5b-9的水平,其可以通过调节补体活性实现缓解、治疗OA的作用。CS-P同样表现出了缓解OA的效果,但作用不显著。5基于近红外光谱分析技术的硫酸软骨素抗补体活性快速筛选方法的建立通过漫反射方式采集了60个不同来源、不同Mw的CS样品的光谱,并利用溶血法测定其一级数据(IC50)；利用因子设计实验选择了一阶导数-SNV-SG亚滑-MC的最佳预处理方法；利用CARS法选择了47个变量建立PLS模型；模型的校正集的相关系数Rc=0.983,验证集的相关系数Rp=0.969,验证集的RMSEP=0.376 mg,RPD=5.46,建立的模型可以用于CS的抗补体活性筛选。结论和意义通过本研究制备了一系列的LMWCSs,研究了LMWCSs与抗补体活性之间的构效关系,揭示△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S双糖结构有利于提高LMWCS的抗补体活性,在缓解、治疗OA中可能具有更好的效果。并对LMWCS-S-O通过调节补体活性缓解OA进行了体外、体内的初步探索,证明鲨鱼来源LMWCS具有通过调节补体系统防治OA的潜在的药用价值。最后建立CS抗补体活性的快速筛选方法,有利于实现CS抗补体活性的快速筛选。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
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本文编号：2489017