超声联合正己酰羧甲基壳聚糖载药纳米液滴的体外成像及抗肿瘤作用的初步研究

发布时间：2019-06-04 05:14

【摘要】：引言:肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病,目前治疗肿瘤的首选方法是手术,其次是化疗、放疗、激素治疗、生物治疗等,常用的化疗药物主要以细胞毒性药物为主,存在靶向性差、毒副作用大、治疗效果不理想的问题。近年研究表明超声联合载药微泡可有效杀伤肿瘤细胞,但是微泡粒径较大,其靶向递送效果有限。全氟戊烷(perfluoropentane,PFP)纳米液滴是超声造影剂的一种,其粒径小于1μm,可穿过肿瘤新生微血管内皮细胞间隙,在超声辐照或加热条件下可气化成微泡,但目前常见的用于制备PFP纳米液滴的包裹材料需有机溶剂溶解,因此残留的有机溶剂易在机体内蓄积引起毒副作用。而正己酰羧甲基壳聚糖(carboxymethyl-hexanoyl chitosan,CHC)是一种天然的高分子材料易溶于水且安全无毒,生物相容性良好。本研究的目的是:通过合成CHC,以阿霉素(Doxorubicin,DOX)为模型药物,制备CHC-PFP-DOX纳米液滴,研究其体外超声成像效果和超声作用下的抗肿瘤作用,为临床治疗肿瘤提供方法依据。本研究包含以下三部分:1、CHC-PFP-DOX纳米液滴的制备及表征2、CHC-PFP-DOX纳米液滴的体外超声成像研究3、超声联合CHC-PFP-DOX纳米液滴抗肿瘤作用的体外研究。第一部分CHC-DOX-PFP纳米液滴的制备及表征目的:合成CHC,用其制备CHC-PFP-DOX纳米液滴,对其进行质量评价。方法:利用羧甲基壳聚糖与正己酸酐合成CHC,通过红外光谱仪和核磁共振波谱仪分析鉴定合成物。采用声振乳化法制备药物载体质量比分别为1:5、1:10、1:20的CHC-PFP-DOX纳米液滴,通过激光粒度仪检测粒径、电位,用透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察其表面形态,用紫外分光光度法计算CHC-PFP-DOX纳米液滴载药量和包封率,利用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法测定DOX浓度,计算CHC-PFP-DOX纳米液滴在超声和非超声作用下的药物累积释放率。结果:成功合成CHC,用其制备出CHC-PFP-DOX纳米液滴,以药物载体质量比为1:5、1:10、1:20制备的CHC-PFP-DOX纳米液滴的粒径分别为(458±43)nm、(286±55)nm和(216±21)nm、包封率为(52.06±10.14)%、(38.67±13.43)%和(9.50±5.50)%,载药量分别为(8.68±1.70)%、(3.21±0.70)%和(0.45±0.26)%。在超声作用下,CHC-PFP-DOX纳米液滴(药物载体质量比为1:5)的药物累积释放率比无超声作用下的高((70.28±3.32)%vs(36.07±1.68)%)。结论:利用羧甲基壳聚糖与正己酸酐可合成CHC;成功制备粒径分布均匀且圆整的CHC-PFP-DOX纳米液滴,以1:5的药物载体质量比可制备具有一定包封率和载药量的CHC-PFP-DOX纳米液滴;超声可促进CHC-PFP-DOX纳米液滴的药物释放。第二部分CHC-DOX-PFP纳米液滴的体外超声成像研究目的:探讨CHC-PFP-DOX纳米液滴超声成像条件,为其应用于超声成像奠定基础。方法:构建成像模型并使用Philips iU-22型超声诊断仪对CHC-PFP-DOX纳米液滴进行体外超声成像。设定不同的成像温度(25℃、37℃、45℃),摸索促发CHC-PFP-DOX纳米液滴气液相变的温度;设定不同的机械指数(Mechanism index,MI),分别以MI=0.4、0.5、0.6的超声参数对CHC-PFP-DOX纳米液滴(浓度:2mg/ml、5mg/ml)进行超声成像,利用Image J软件测定各组超声成像的灰度值,以定量评价各组成像效果。结果:在25℃条件下,纳米液滴没有成像效果,而在45℃和37℃条件下,纳米液滴可成像,其标准化灰度值分别为7.52±1.71和12.42±1.51,两组间有统计学差异(P0.05);浓度为5mg/ml的纳米液滴标准化灰度值显著大于浓度为2mg/ml的纳米液滴的标准化灰度值(P0.05);浓度为5mg/ml纳米液滴在各MI条件下成像具有差异,MI=0.5时,其标准化灰度值显著高于MI=0.4的标准化灰度值(P0.05),而M=0.5与MI=0.6之间的标准化灰度值没有显著性差异(P0.05)。纳米液滴在温度为37℃、MI=0.5、浓度为5mg/ml条件下超声成像,其标准化灰度值显著高于声诺维的标准化灰度值((11.54±1.41)vs(8.65±0.95),P0.05)。结论:纳米液滴在温度为37℃、MI=0.5、浓度为5mg/ml条件下,可获得良好的超声成像效果且效果优于声诺维。第三部分超声联合CHC-PFP-DOX纳米液滴抗肿瘤的体外研究目的:探讨CHC对正常细胞和肿瘤细胞的毒性作用,研究超声联合CHC-PFP-DOX纳米液滴的抗肿瘤作用。方法:在三种浓度(1mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml)的CHC条件下培养,观察人血管平滑肌细胞和A2780细胞的生长情况。摸索最佳的超声参数组合,设置不同的药物浓度梯度以确定DOX的剂量。研究超声联合CHC-PFP-DOX纳米液滴抗卵巢癌细胞的作用,实验分组:空白组、US组、CHC-PFP组、CHC-PFP-DOX组、DOX组、US+CHC-PFP组、US+DOX组、US+CHC-PFP-DOX组,利用CCK-8法检测各组细胞存活率。结果:在1mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml的CHC浓度条件下,人血管平滑肌细胞的存活率分别为(98.95±6.36)%,(98.11±6.49)%,(96.63±3.69)%,无统计学差异(P0.05);A2780细胞的存活率分别为(99.55±8.9)%,(96.32±6.9)%和(93.91±2.81)%,无统计学差异(P0.05)。US组、CHC-PFP组、CHC-PFP-DOX组、DOX组、US+CHC-PFP组、US+DOX组、US+CHC-PFP-DOX组,细胞存活率分别为(92.50±7.21)%,(92.90±2.16)%,(85.69±13.22)%,(49.56±4.64)%,(85.24±2.73)%,(45.62±8.46)%,(34.60±4.11)%。US+CHC-PFP-DOX组与DOX组,US+CHC-PFP-DOX组与US+DOX组之间存在统计学差异(P0.05)。结论:CHC对正常细胞和肿瘤细胞毒性低,超声联合CHC-PFP-DOX纳米液滴可提高药物对肿瘤的杀伤作用,为其应用于肿瘤治疗奠定基础。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943;R96

【参考文献】