NLRP3炎症小体在无烟气烟草水提取物致线粒体损伤中的作用研究

发布时间：2019-06-04 08:27

【摘要】：第一部分无烟气烟草水提取物对线粒体损伤作用的研究 目的：研究无烟气烟草水提取物（Smokeless tobacco water extract，STWE）对线粒体的损伤作用。方法：选取人肝癌细胞株HepG2、人胚肺成纤维细胞株MRC-5为工具细胞，常规培养，当细胞贴壁率达到90%以上后，收集细胞进行以下实验。（1）采用MTT法观察不同浓度STWE对HepG2和MRC-5细胞的增殖影响，计算上述细胞的半数抑制浓度IC50。以STWE最大可配浓度10mg/ml为初始浓度，倍比稀释为STWE不同作用浓度，同时设置空白对照，37℃，5%CO2培养箱中孵育48h后，检测490nm处吸光度值（OD值），计算IC50。（2）根据MTT实验结果，在HepG2和MRC-5细胞上，选取625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml三个STWE作用浓度，，同时设空白对照，作用24h。透射电镜检测细胞形态学改变。（3）选取625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml三个STWE浓度，检测STWE线粒体毒性。①线粒体膜电位检测：JC 1试剂盒检测各实验组细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平。②细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测：GEMNED活性氧高质荧光检测试剂盒，检测各实验组细胞ROS水平。③线粒体DNA编码基因检测：提取各实验组细胞total RNA，逆转录合成cDNA，Real-Time PCR法检测线粒体DNA编码12S rRNA、NDⅠ、COXⅡ基因表达水平。（4）细胞凋亡检测：FITCAnnexin VApoptosis Detection Kit Ⅰ检测各实验组细胞凋亡水平。（5）细胞周期检测：Real-Time PCR法检测细胞周期相关基因P53、CDK2和MDM2基因表达水平。结果：（1）MTT结果显示，梯度浓度STWE作用48h后， HepG2、MRC-5细胞增殖率成剂量依赖性下降。HepG2、MRC-5两种细胞的IC50值分别为447.00μg/ml和441.00μg/ml。据此选取IC50上下三个剂量625.00μg/ml、312.50μg/ml、156.25μg/ml为给药剂量。（2）细胞形态学透射电镜检测结果：与空白对照组相比，STWE各剂量组细胞出现不同程度的细胞微绒毛减少或消失、空泡、水肿、细胞核及染色质皱缩等改变，以625.00μg/mlSTWE组细胞损伤最明显。（3）①线粒体膜电位流式细胞仪检测结果显示，STWE能剂量依赖性地降低HepG2和MRC-5细胞线粒体膜电位。②细胞ROS流式结果显示，STWE能剂量依赖性地增加HepG2和MRC-5细胞ROS水平。③线粒体DNA编码基因检测结果：与空白对照组相比，STWE各剂量组均可上调HepG2细胞和MRC-5细胞线粒体DNA编码的12SrRNA、NDⅠ、COXⅡ基因mRNA表达水平。（4）细胞凋亡流式结果显示：与空白对照组相比，STWE能剂量依赖性地升高细胞凋亡水平。（5）细胞周期检测：与空白对照组相比，STWE各剂量组细胞的周期相关基因CDK2、MDM2mRNA水平表达在HepG2和MRC-5细胞内都升高，而HepG2中未检测到P53基因表达，MRC-5细胞P53表达降低。结论：STWE对人肝癌细胞株HepG2、人胚肺成纤维细胞株MRC-5线粒体都有不同程度的损伤作用，且剂量依赖性造成线粒体膜电位下降、细胞凋亡率增高、活性氧产生增多，并且有引起细胞恶变的趋势。 第二部分NLRP3炎症小体在无烟气烟草水提取物致线粒体损伤中的作用 目的：研究不同浓度STWE作用下，人肝癌细胞株HepG2、人胚肺成纤维细胞株MRC-5及小鼠肺组织内NLRP3炎症小体表达变化，探讨NLRP3炎症小体及其效应因子在线粒体损伤中的作用。方法：（一）体外实验。根据第一部分实验结果，选取312.50μg/ml和156.25μg/ml的STWE为给药浓度。实验共五组，分别为：空白对照组、156.25μg/ml STWE组、单独LPS刺激4h组、LPS预处理4h+156.25μg/mlSTWE组、LPS预处理4h+312.50μg/ml STWE组。（1）提取各实验组细胞total RNA，Real-Time PCR检测NLRP3炎症小体各组分基因NLRP3、ASC和Caspase-1的表达变化。（2）提取各组细胞总蛋白，Western Blot检测炎症小体相关组分蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达变化。（3）收集各组细胞培养液上清，使用Human IL-1βImmunoassay Kit测定NLRP3炎症小体激活后释放的主要效应因子IL-1β的浓度。（二）体内试验。清洁级C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，随机分为生理盐水对照组、5mg/kg STWE组、10mg/kg STWE组、20mg/kg STWE组，连续灌胃给药15天。（1）给药结束后，取小鼠肺脏组织做病理切片，观察不同浓度组STWE对肺组织的损伤。（2）同时，取小鼠肺脏组织做免疫组化，检测不同STWE剂量组小鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18水平。结果：（一）体外实验。（1）RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，LPS预处理再联合不同浓度STWE刺激组NLRP3、ASC和Caspase-1基因表达水平均显著性升高（P0.05）。（2）Western Blot结果显示，与空白对照组相比，LPS预处理再联合两个剂量STWE刺激组NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达水平均明显升高。（3）酶联免疫吸附实验结果显示，与空白对照组相比，LPS预处理再给予不同浓度STWE刺激组IL-1β蛋白分泌水平均显著性升高（P0.05）。（二）体内实验。（1）病理组织结果显示，生理盐水对照组和5mg/kgSTWE作用组肺组织基本正常，10mg/kg及20mg/kg STWE组肺组织则分别出现不同程度的巨噬细胞聚集和局灶性炎症。（2）免疫组化结果显示，生理盐水对照组NLRP3、ASC和Caspase-1表达很低，随着STWE作用浓度的升高，三者的表达呈上升的趋势。IL-1β和IL-18在生理盐水对照组和5mg/kg STWE组小鼠肺脏组织细胞中无表达或表达非常低，10mg/kg和20mg/kg STWE组表达有升高趋势。结论：体外实验证实STWE能够激活NLRP3炎症小体，促进NLRP3、Caspase-1、ASC等的表达。体内实验证明高剂量的STWE同时能促进炎症因子IL-18和IL-1β的分泌和表达的趋势。 第三部分NLRP3、ASC和Caspase-1三种基因敲除小鼠的饲养、繁殖与基因型鉴定 目的：饲养、繁殖及鉴定NLRP3基因敲除小鼠、ASC基因敲除小鼠和Caspase-1基因敲除小鼠，为本课题组后续实验研究提供模型动物。方法：将引进的NLRP3+/-小鼠、ASC+/-小鼠、Caspase-1+/-小鼠进行饲养及品系内配种繁殖，提取子代小鼠的耳朵基因组DNA，用PCR方法和T7E1酶切法鉴定基因型，依照孟德尔遗传定律可能得到野生型、杂合子及纯合子三种基因型。结果：成功掌握了NLRP3、ASC和Caspase-1三种基因敲除小鼠的饲养及繁殖技术，并分别获得了较多的上述三种基因敲除纯合子小鼠。结论：正确的小鼠饲养、繁殖及鉴定方法，有助于快速获得NLRP3、ASC、Caspase-1三种基因敲除纯合子小鼠。
[Abstract]:Study on the effect of the first part of the non-flue-gas-free tobacco water extract on the mitochondrial injury Objective: To study the damage of the non-smoke-free tobacco water extract (STWE) to the mitochondria. The method comprises the following steps of: selecting human liver cancer cell line HepG2 and human embryonic lung fibroblast cell strain MRC-5 as a tool cell, (1) The effect of STWE on the proliferation of HepG2 and MRC-5 cells was observed by MTT method, and half of the inhibition concentration IC5 of the cells was calculated. 0. The absorbance value (OD value) at 490 nm was measured after incubation for 48 h in the blank control,37 鈩

本文编号：2492595