银杏叶片对大鼠苯磺酸氨氯地平药动学的影响以及乙醇抑制离体大鼠胃收缩反应的研究

发布时间：2019-07-12 10:33

【摘要】：氨氯地平为第三代二氢吡啶类Ca~(2+)通道阻滞药,主要通过阻断“L-型电位动作”钙通道。阻滞血管平滑肌细胞外的Ca~(2+)进入细胞内,松弛平滑肌,降低心肌收缩力、降低频率和减慢传导;此外,氨氯地平可通过提高细胞膜钙泵活性,从而降低脑浆游离钙浓度来降低血压。氨氯地平口服吸收完全,较其他的钙离子拮抗剂高,但其过程缓慢,在口服后的6~12h才呈现血药浓度峰值,故氨氯地平具有降压持续时间久、血压峰谷波动较小等特点,可以使氨氯地平具有延迟高血压发生并减轻高血压发作程度的优点。银杏叶具有药用价值,可以有效的预防和治疗高血压、冠心病、心绞痛等心脑血管疾病,广泛应用于临床。临床上常见与其他心脑血管药物联合使用,有报道称,银杏叶滴丸联合苯磺酸氨氯地平可以显著降低老年高血压患者血浆s DR4、s DR5的水平,改善老年高血压患者心肌细胞凋亡。但是从药代层面评估银杏叶对氨氯地平的影响尚未见报道。银杏叶片是否对其药动学有影响,值得关注。随着社会发展,饮酒成为人类的一种生活习惯,白酒、啤酒、红酒、香槟等不仅影响了人们的生活,更影响了健康。饮酒时乙醇首先经胃吸收入血,其在胃平滑肌中的浓度高于血中的浓度,故对胃肠道的影响更为常见。有研究指出乙醇可直接损害胃粘膜、对消化道平滑肌具有毒性作用等不良反应。本课题组建立了大鼠离体胃底、胃体、胃窦、贲门和幽门环行肌的药理学实验方法,并探索了毒蕈碱(M)受体及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受体介导胃平滑肌收缩的药理学特征。但是,乙醇对大鼠离体胃底、胃体、贲门和幽门环行肌的作用尚不清楚。第一部分中药银杏叶片对苯磺酸氨氯地平在大鼠体内药动学的影响目的:建立检测苯磺酸氨氯地平代谢产物的HPLC-Orbitrap-Fusion方法,建立测定苯磺酸氨氯地平及其代谢产物的UPLC-MS/MS同时测定方法,通过比较单独灌胃给予苯磺酸氨氯地平与合用中药复方制剂银杏叶片后大鼠体内苯磺酸氨氯地平药动学参数的变化,以及苯磺酸氨氯地平代谢产物的变化,探讨银杏叶片对苯磺酸氨氯地平药动学是否有影响。方法:色谱条件:色谱柱:Xbridge C18色谱柱(100 mm×3 mm,3.5μm);流动相A:0.1%甲酸水溶液,流动相B:乙腈,梯度洗脱;进样量为2μL;流速:0.6 m L/min;柱温箱:30°C;样品室温度:4°C;梯度洗脱条件如下:0 min,30%B;3.5 min,50%B;8.5 min,80%B;10 min,90%B;10.5 min,90%B;11 min,30%B;内标:哌唑嗪;质谱条件:UPLC-MS/MS:离子化方式:电喷雾离子化源(electrospray ionization,ESI);检测方式:正离子检测;扫描方式:多反应检测(multiple reaction monitoring,MRM);毛细管电压3 k V;去溶剂气流速为1000 L/h,源温度:150°C,去溶剂温度500°C;并选择合适的被测物及内标物的检测离子对、驻留时间、扫描时间、锥孔电压和碰撞电压等参数。HPLC-Orbitrap-Fusion:正、负离子模式全扫描分析条件,正离子喷雾电压:3.5 k V,负离子喷雾电压:2.5 k V;鞘气流速:40 Arb,辅助气流速:12 Arb,尾气流速1 Arb;离子传输管温度:330°C,喷雾器温度:315°C,扫描范围:100-600 m/z,质量分辨率:60000。实验方法:1采用HPLC-Orbitrap-Fusion和Mass Frontier 7.0软件分析代谢物的种类及结构。2采用UPLC-MS/MS分析银杏叶片对大鼠血浆中苯磺酸氨氯地平药代动力学的影响。将20只大鼠随机分为2组,每组10只,对照组灌胃给予2 m L蒸馏水,实验组灌胃给予银杏叶片溶液2 m L,每日一次,连续给药15天,第16天,每只大鼠灌胃给予苯磺酸氨氯地平2 m L(相当于氨氯地平1 mg/Kg),给药前12 h禁食,自由饮水,分别于给药前0.5 h和0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼底静脉丛取血0.5 m L于肝素抗凝管内,离心分离血浆,-20°C保存,备用。药动学参数处理:测定每只大鼠各取血点的氨氯地平血药浓度及代谢物的峰面积,采用药动学软件Win Nonlin对其进行处理得到相关药动学参数。实验数据均以Mean±SD表示。通过统计学软件Graph Pad Prism 5.0、Graphpad Instart 3.0依次将实验组大鼠与对照组大鼠间主要药动学参数进行双因素方差统计学分析。P值小于0.05则认为两组间差异有统计学意义。结果:苯磺酸氨氯地平、哌唑嗪的保留时间分别为3.38 min和1.12min。血浆内源性杂质不干扰苯磺酸氨氯地平和内标物质出峰及测定。苯磺酸氨氯地平的回归曲线为Y=0.7887C+0.3851(R2=0.9996),线性范围为0.15-60 ng/m L,定量下限为0.15 ng/m L。低(0.3 ng/m L)、中(5 ng/m L)、高(30 ng/m L)浓度质控样品溶液的日内和日间精密度RSD均低于15%,平均回收率分别为67.67%、70.00%和80.16%,平均基质效应RSD分别为109%、100%、100%,放置在室温4 h、24 h与-20°C冷冻储存30天,血浆样品均稳定。未合用中药组大鼠苯磺酸氨氯地平的主要药动学参数分别为AUC_(0-t):64.40±25.54 ng/m L·h;AUC_(0-∞):74.58±29.81 ng/m L·h;t_(1/2):6.91±1.64 h;T_(max):1.37±0.44 h;Cl:0.02±0.006 L/h/kg;MRT:10.17±0.60;C_(max):5.73±3.16ng/m L。合用银杏叶片后,苯磺酸氨氯地平的主要药动学参数分别为AUC_(0-t):33.49±10.70 ng/m L·h;AUC_(0-∞):36.72±11.06 ng/m L·h;t_(1/2):6.70±1.07h;T_(max):2.50±1.30 h;Cl:0.03±0.008 L/h/kg;MRT:10.26±1.43;C_(max):3.29±1.34 ng/m L。将未合用中药组与合用银杏叶组大鼠苯磺酸氨氯地平的主要动力学参数进行统计分析,结果显示,与未合用中药组相比,AUC_(0-t)、AUC_(0-∞)和C_(max)明显减少,T_(max)和Cl明显的增加,且具有统计学意义(P0.05)。通过HPLC-Orbitrap-Fusion分析以及Mass Frontier 7.0软件对其结构的解析,共确定27种代谢物。在银杏叶对苯磺酸氨氯地平药动学影响实验中,未合用中药组大鼠血浆样本中共检测出9种代谢产物,分别为M2、M3、M5、M7、M14、M15、M16、M18、M23。在合用银杏叶片组大鼠血浆样本中共检测出11种代谢产物,分别为M2、M3、M5、M7、M9、M14、M16、M17、M18、M24、M22。其中代谢物M15和M23只存在于未合用中药组;同样,代谢物M9、M17、M22、M24只存在于合用银杏叶片组。结论:本文所建立的UPLC-MS/MS测定苯磺酸氨氯地平及其代谢物的方法准确,灵敏度高、重现性好,适用于大鼠体内血浆中苯磺酸氨氯地平浓度的测定;本文所建立的HPLC-Orbitrap-Fusion方法分辨率高、分析速度快,共检测出27种代谢产物。适用于大鼠体内血浆中苯磺酸氨氯地平代谢物种类的检测。并且证明,苯磺酸氨氯地平合用银杏叶片时,后者显著抑制大鼠体内苯磺酸氨氯地平的吸收,加快其清除,且代谢物种类发生了改变。第二部分乙醇对大鼠胃不同区域环行肌M受体和5-HT受体介导收缩反应的选择性抑制作用目的:利用大鼠胃不同区域环行肌标本,研究乙醇对M受体和5-HT受体介导的收缩反应是否具有选择性抑制作用。方法:制备大鼠离体胃底、胃体、贲门和幽门环行肌标本,观察卡巴胆碱(carbachol,CCh)或5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)诱发的收缩反应及乙醇的作用。结果:0.05‰~0.5‰乙醇不影响CCh诱发的胃底和贲门环行肌收缩反应以及5-HT诱发的胃底和胃体环行肌收缩反应(P0.05)。但是0.1‰和0.5‰乙醇显著抑制了CCh诱发的胃体环行肌收缩,Emax值(g)由对照组的12.18±0.33降至10.88±0.41,-Log EC50值由对照组的6.33±0.05降至6.12±0.06(P(27)0.05)。同浓度乙醇显著抑制了CCh诱发的幽门环行肌收缩,Emax值(g)由对照组的2.87±0.15降至2.2±0.13,-Log EC50值由对照组的6.49±0.10降至6.05±0.09(P(27)0.01)。乙醇预处理贲门环行肌前,5-HT诱发贲门环行肌收缩的Emax值(g)是2.93±0.35,-Log EC50值是6.17±0.21;0.1‰和0.5‰浓度的乙醇显著抑制了5-HT诱发的贲门环行肌收(P(27)0.05),其Emax值(g)降至2.1±0.30(P(27)0.05),-Log EC50值未发生显著改变。结论:乙醇对大鼠胃不同区域环行肌收缩功能的抑制强度是:贲门(5-HT)幽门(CCh)胃体(CCh)。在受体激动剂诱发环行肌收缩反应的抑制特点方面,乙醇对CCh的活性及其与受体的亲和力均有抑制作用,但是乙醇仅抑制5-HT的活性。
文内图片：氨氯地平和哌唑嗪的液相色谱图：A大鼠空白血浆样品；B大鼠空

图片说明： C-1 氨氯地平和哌唑嗪的液相色谱图：A 大鼠空白血浆样品；B 大白血浆加样（上：苯磺酸氨氯地平，，下：哌唑嗪）；C 大鼠血浆.2-1 Chromatograms ofAML and prazosin: (A) blank plasma; (B)Aand prazosin spiked in blank plasma (up:AML, down: prazosin)AML and prazosin in plasma+MS2 (409.00): 1.370 to 1.638 min from Sample 1 (TuneSampleID) of anlvdipingerji2.wiff (Turbo Spray), Cent... Max. 1.1e7 cps.4.50e65.00e65.50e66.00e66.50e67.00e67.50e68.00e68.50e69.00e69.50e61.00e71.05e71.10e71.13e7Intensity,cps238.2294.2
文内图片：大鼠血浆氨氯地平标准曲线Y=0.7887C+0.3851R2=0.9996

图片说明：图 3 大鼠血浆氨氯地平标准曲线 Y = 0.7887C + 0.3851 R2 = 0.9996(weighting:1/x^2)Fig.3 Standard curve ofAMLin plasma of rats, calibration forAMLY =0.7887C + 0.3851 R2 = 0.9996 (weighting:1/x^2)
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R965

【参考文献】