Sirt3介导的COX乙酰化在氧化应激诱导细胞凋亡中的作用研究

发布时间：2019-07-15 08:26

【摘要】：细胞凋亡是一种选择性的细胞自杀式过程,需要特定的细胞死亡程序的参与。大量研究表明氧化应激是诱导细胞凋亡的重要因素。有研究发现,氧化应激状态下调线粒体去乙酰化酶3(Silent mating type information regulation 2 homolog3,Sirt3)的蛋白表达,导致线粒体呼吸链关键酶的乙酰化水平增加,活性下降。多亚基的细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,COX)是线粒体呼吸链复合物IV,在电子传递过程中发挥重要作用。与氧化应激密切相关的老年退行性疾病和缺血/再灌注的细胞凋亡过程中均发现COX活性降低。但是目前并不清楚细胞凋亡是否与COX乙酰化状态升高有关。据此,本论文将考察Sirt3与COX乙酰化水平的关系,并进一步探讨其在氧化应激诱导的细胞凋亡中的作用。首先,本论文研究Sirt3对COX乙酰化水平影响。采用30 m M Sirtuin家族抑制剂—尼克酰胺(nicotinic acid amide,NAM)作用于小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)3 h后,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)观察Sirt3蛋白表达和COX乙酰化水平变化。结果发现Sirt3蛋白表达明显减少,COX乙酰化水平显著增加。利用50 n M、100 n M si RNA干扰Sirt3后,利用紫外分光光度计检测COX的活性,根据IP分析COX亚基的乙酰化水平改变,WB检测凋亡相关蛋白。结果也显示COX活性明显受到抑制,且COX的各亚基中COX-1乙酰化水平特异性升高,其余各亚基乙酰化水平变化不明显。此外,Cyt c释放到胞浆中增加,Caspase 3被激活,引起NIH/3T3细胞凋亡。上述结果表明抑制Sirt3表达,上调COX-1亚基乙酰化水平。在这部分研究的基础上,再通过0.5 ug/m L、1 ug/m L质粒过表达Sirt3后,采用IP观察COX-1亚基乙酰化水平,结果显示Sirt3蛋白过表达后,COX-1亚基乙酰化水平明显降低。综上实验结果说明Sirt3对COX-1亚基乙酰化具有调控作用。其次,使用自由基诱导剂AAPH导致NIH/3T3细胞发生凋亡,在此细胞模型中研究Sirt3对COX乙酰化的调控及作用。先根据噻唑蓝染色观察AAPH对NIH/3T3细胞的增殖抑制作用,利用细胞流式仪检测ROS生成量和线粒体膜电位变化。结果发现,AAPH作用NIH/3T3细胞12 h后,细胞增殖受到明显抑制,抑制率呈剂量依赖性增加,IC50为7.512±0.137 m M;5 m M、7.5 m M AAPH作用于NIH/3T3细胞12 h后ROS的生成量显著增加,线粒体的膜电位明显降低,细胞处于氧化应激状态。接下来采用Western blot检测Caspase 3和Cyt c的蛋白表达,液闪仪检测ATP生成量,紫外分光光度计检测COX的活性。结果显示,给予AAPH后凋亡指示蛋白Cleaved Caspase 3表达明显增多;分离细胞器后,检测到胞浆中Cyt c蛋白表达量增加。结果显示AAPH导致线粒体氧化应激后,线粒体Cyt c释放到胞质中,激活Caspase 3,引起细胞凋亡。此外,AAPH诱导细胞凋亡后,COX的活性显著性降低,呼吸链障碍,导致细胞中ATP含量下降。最后,采用5m M AAPH作用于NIH/3T3细胞3、6、9、12 h后,通过Western blot观察Sirt3蛋白表达及作用12 h后COX-1乙酰化水平。结果显示给予AAPH后,NIH/3T3细胞中Sirt3的蛋白表达水平呈时间依赖性降低,COX-1的乙酰化水平也在AAPH处理后明显升高。以上结果提示,AAPH导致线粒体氧化应激后,抑制Sirt3的蛋白表达,引起COX-1的乙酰化水平升高,COX活性降低,无法正常接收Cyt c传递的电子,使Cyt c释放到胞质中,激活Caspase 3,引起细胞凋亡。最后,我们利用SD大鼠脑缺血/再灌注模型研究Sirt3对COX乙酰化的调控及作用。40只SD大鼠,随机分为4组,每组10只。除假手术(sham)组外,其余各组根据体重采用不同线栓阻塞大鼠大脑中动脉2 h后,拔出线栓,分别再灌注24 h、48 h、72 h,建立SD大鼠脑缺血/再灌注模型。采用2%红四唑氮(2,3,5-tripheyl tetrazolium Chloride,TTC)避光染色半小时,观察脑组织梗死情况。心脏灌流后,取大鼠皮层,匀浆后取上清,利用荧光酶标仪测定ROS生成速率。结果显示再灌注不同时间后,各组脑组织梗死情况均明显,梗死体积较Sham组有显著性增加。同时,与Sham组相比,各模型组再灌注大鼠ROS生成速率均明显上升,再灌注72 h组ROS生成速率最快。进一步研究中采用紫外分光光度计检测COX的活性,Western blot检测Sirt3蛋白表达,IP观察COX-1亚基乙酰化变化。结果提示大脑皮层中Sirt3的蛋白表达随着再灌注时间的增加逐渐减少,72 h后达显著水平。此外,缺血/再灌注后皮层组织中COX活性也受到明显抑制,72 h后COX-1乙酰化水平显著升高。总之,脑缺血/再灌注引起ROS大量释放,出现氧化应激,抑制Sirt3蛋白表达,引起皮层中COX-1乙酰化水平增加,COX活性下降,出现Cyt c外流,激活凋亡因子,最终引起脑神经细胞大量凋亡,出现脑梗死。综上所述,Sirt3可以调控COX-1的乙酰化水平。线粒体氧化应激后,自由基大量释放,引起Sirt3蛋白表达减少,导致COX-1乙酰化水平增加,COX活性下降,无法正常传递Cyt c转移的电子,使携带大量负电荷的Cyt c被磷脂双分子层翻转释放到胞浆中,导致Caspase家族被激活,启动凋亡信号通路。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

【参考文献】